Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare la funzione del fattore di trascrizione NF kappa B nel cervello adulto. Ciò si ottiene allevando per la prima volta topi transgenici che inibiscono specificamente l'attività di NF kappa B nei neuroni. La seconda fase della procedura consiste nel testare le conseguenze comportamentali dell'inibizione di NF kappa B utilizzando il modello spaziale, separazione o fienili, labirinto.

Il terzo passo è l'attenta profusione degli animali, la rimozione del cervello e la corretta sezionazione dello stesso. Il passaggio finale consiste nell'analizzare gli effetti istologici e strutturali, come la visualizzazione delle proiezioni di fibre muschiose mediante immunocolorazione. In definitiva, l'utilizzo del test comportamentale seguito dall'istologia può correlare i cambiamenti nell'apprendimento dipendente dal giro dentato con i cambiamenti strutturali nei tessuti associati.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come Mars Vase è che i legami di separazione spaziale offrono l'opportunità di misurare in modo specifico i processi di apprendimento anti-bambino-dipendente, nonché la neurodegenerazione e la rigenerazione in quest'area del cervello. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi adulta, come l'apprendimento come separazione di modelli speciali. La dimostrazione del labirinto sarà fatta da Angela Kula, un tecnico del mio laboratorio.

La perfusione sarà presentata da Peter Hyman, un ricercatore associato. Quindi il sezionamento dei cervelli sarà mostrato dal tecnico Ulrich KA. E infine, la microscopia confocale a scansione sarà presentata da Jeanine Muah, una dottoranda del mio laboratorio Effettuare la separazione del modello spaziale.

Test comportamentali Barnes Maze secondo le linee guida internazionali e locali. Per questo test, è importante utilizzare solo topi maschi di almeno sei mesi di età. Per ogni serie di test, gli animali devono avere meno di quattro giorni di età e lo stesso operatore deve condurre tutti i test prima del test.

I topi dovrebbero essere nutriti con una dieta standard in modo che siano motivati dal cibo dolce. Per impostare prima il test, procurati una piastra bianca di 120 centimetri di diametro in plastica dura. Le stecche extra del labirinto possono essere realizzate con materiali diversi e possono avere forme diverse.

È importante sottolineare che devono avere un contrasto elevato per essere chiaramente riconosciuti dalle ruote da corsa degli animali. Scale e tunnel sono tutti buoni spunti. Posiziona la piastra sotto diverse lampade fluorescenti al neon moderatamente intense, in modo che i topi siano motivati a uscire dalla luce.

L'ambiente deve essere a umidità controllata e a una temperatura costante di 22 gradi Celsius. Ora imposta il sistema di tracciamento video. Posizionare la fotocamera a 115 centimetri sopra il centro della piastra.

Quindi, attacca stecche extra multicolori a un panno di colore bianco che si adatta al piatto. Posizionali vicino al centro del panno in modo che siano facilmente visibili agli animali. Ora, pulisci accuratamente la piastra con il disinfettante rapido in grado di rimuovere qualsiasi odore dalla configurazione sperimentale.

Posiziona sette casette gialle identiche sul piatto bianco. Le loro posizioni dovrebbero essere segnate in modo inequivocabile un giorno prima di iniziare i test, abituare ogni mouse al disco. Posiziona le ricompense in pellet di cibo dolce come un anello di frutta squartato all'interno di ciascuna delle sette case del cibo per la prova dell'abitazione.

Metti ogni mouse sul punto iniziale del piatto e lascialo esplorare per 10 minuti. Registra questa esplorazione tra i topi. Pulire la piastra circolare e le case del cibo con disinfettante rapido.

Rifornisci anche le ricompense alimentari. Nei sette giorni consecutivi successivi, eseguire le prove di prova per i test. Tutte le case, tranne una, sono chiuse da nastro adesivo trasparente per l'intero esperimento.

È sempre la stessa casa. Ogni casa è ancora carica di una ricompensa e il test viene eseguito come la prova di assuefazione. Esegui i test alla stessa ora del giorno per ogni animale per evitare variazioni circadiane.

Successivamente, analizza la latenza, la distanza percorsa e gli errori utilizzando statistiche appropriate. I software definiscono gli errori come l'avvicinarsi alla casa di cibo sbagliata o il contatto con la scatola corretta, ma non riuscire a entrare e recuperare la ricompensa. Per confrontare i gruppi utilizzare un'ANOVA a due vie con un test post hoc bon fer.

Dopo aver anestetizzato l'animale con un'iniezione interperitoneale di vertina, perfonderlo accuratamente per via transcordiale con PBS contenente eparina e propano. Fai un buco nel ventricolo sinistro usando un ago calibro 26. Fai anche un taglio nell'atrio destro per consentire al sangue e all'otto perfuso di defluire.

Inserire l'ago di perfusione nel ventricolo sinistro in corrispondenza del foro con un angolo retto e a una profondità di uno o due millimetri. Utilizzare da 1,2 a 1,4 metri di pressione idrostatica e perfondere il mouse per due o quattro minuti. Seguire l'eparina e il propano con il 4% di paraldeide in PBS per 10-15 minuti.

La perfusione dovrebbe essere una velocità di 15 millilitri al minuto. Ora seziona il cervello. Dovrebbe essere bianco pallido senza vasi sanguigni rossi visibili.

Fissare tutti i cervelli raccolti in 4% di para formaldeide a quattro gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo. Cryo protegge il cervello nel 30% di saccarosio in PBS conservarli a quattro gradi Celsius per almeno 24 ore dopo.

I cervelli vengono congelati su un tavolino criogenico e tagliati in sezioni orizzontali spesse 40 micron. Dopo aver colorato le sezioni con un anticorpo per il neurofilamento M, le proiezioni delle fibre muschiose possono essere visualizzate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale alla lunghezza d'onda appropriata per l'anticorpo fluorescente. Avvia la scansione a basso ingrandimento e orienta verso l'ippocampo e le proiezioni delle fibre muschiose.

Quindi, a un ingrandimento più elevato, raccogli scansioni di taglio cesareo ad alta risoluzione delle fibre muschiose per l'analisi per studiare l'espressione del transgene I kappa B alfa AA one. Nel topo transgenico doppio sono stati isolati, criosezionati e colorati con un anticorpo contro la scansione laser confocale GFP. La microscopia ha rivelato un'elevata espressione del transgene nella regione CA uno, nella regione CA tre e nella DG per determinare il tipo di cellula più precoce che esprime CAMK due alfa guidato I kappa B alfa AA uno nella regione neurogena ippocampale.

Sezioni criogeniche di ippopotamo Campi da I Kappa BTTA. Gli animali sono stati colorati per la doppia courtina e l'analisi confocale transgenica ha rivelato segnali GFP in giovani cellule di granuli DCX positive contrassegnate dalle frecce che indicano l'induzione dell'espressione del transgene da parte dell'attività alfa due di CAMK. Le sezioni coronali dell'ippocampo dei topi i kappa BTTA e i Kappa B meno sono state colorate per il neurofilamento M per visualizzare le proiezioni di fibre muschiose e rivelare l'organizzazione complessa e vescicolare nei topi I kappa BTTA.

Le proiezioni delle fibre muschiose erano gravemente compromesse. Inoltre, l'inibizione di NF kappa B ha portato a una riduzione significativa dello spessore della lama e di un volume DG inferiore per studiare le potenziali ragioni del drammatico difetto strutturale. Fette di ippocampo fresche non fissate provenienti da topi di controllo e I kappa BTTA sono state colorate con fluoro giada C, che consente il rilevamento specifico della morte delle cellule neuronali.

Un numero notevolmente aumentato di neuriti degenerativi è stato osservato negli animali transgenici doppi rispetto ai controlli transgenici singoli. Inoltre, un aumento significativo di cellule capaci positive è stato rilevato nei topi I kappa BTTA. Al contrario, la colorazione immunoistochimica contro DCX ha rivelato un aumento significativo della quantità di cellule DCX positive nel cervello dei topi I kappa BT.

Inoltre, le cellule d CX positive in I kappa B TTA hippo Campi non sono state disposte esclusivamente nella zona subgranulare, ma sono state trovate anche nelle regioni più profonde del dg. Mentre i progenitori D CX positivi negli animali di controllo erano localizzati quasi esclusivamente all'interno della zona subgranulare. Il test dell'aumento della quantità di cellule che esprimono DCX è stato il risultato della maturazione di progenitori precedenti o direttamente dovuto alla proliferazione di cellule DCX positive.

BRDU è stato iniettato per via intraperitoneale di topi kappa BTTA e di controllo, che sono stati poi criosezionati e colorati con DCX e BRDU per l'analisi della proliferazione. Il BRDU è stato iniettato una volta, seguito da un'analisi dopo 24 ore. Per l'analisi della differenziazione, sono state eseguite tre iniezioni al giorno, seguite da analisi dopo sette giorni dopo una singola iniezione di BRDU.

Non sono state osservate differenze significative nel numero totale di cellule BRDU positive tra I, kappa BTTA negativi e animali di controllo. Al contrario, l'approccio delle tre iniezioni seriali ha rivelato un numero chiaramente maggiore di cellule B-R-D-U-D-C-X positive nella DG di I capa, BTTA. I topi hanno disturbato la differenziazione o l'integrazione delle cellule che esprimono DCX possono avere un numero aumentato di cellule e le cellule di tipo tre possono essere state coinvolte per testare specificamente il comportamento dei topi doppi transgenici.

In un compito dipendente dalla DG, è stato impiegato l'S-P-S-B-M. Gli animali di controllo I kappa B hanno esplorato le case di alimentazione in serie il primo giorno dell'esperimento. Dopo sette giorni di addestramento, gli animali sono stati in grado di trovare direttamente la casa del cibo aperta.

Al contrario, gli animali IA BTTA continuano a esplorare le case di ristorazione in serie anche dopo l'addestramento. L'osservazione di aumenti significativi delle distanze percorse e di latenze e tassi di errore più elevati negli animali I kappa BTTA rispetto agli animali di controllo i Kappa B suggerisce che questi animali presentavano gravi difetti di apprendimento. Una volta stabilita, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per animale se viene eseguita correttamente dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica potrebbe aprire la strada ad altri neuroscienziati interessati a compiti dipendenti dai giroscopi daid come la neurogenesi, la degenerazione o la rigenerazione nei topi.