Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'entità dell'organizzazione miofibrillare nelle larve di zebrafish traslucide e quantificare la loro distanza di nuoto in risposta alla stimolazione tattile per entrambi i metodi. Ciò si ottiene prima accoppiando il pesce zebra e poi raccogliendo uova vitali nella seconda fase del test per la valutazione della struttura muscolare. Un embrione di pesce zebra anestetizzato rivestito viene posizionato direttamente tra due lenti polarizzate su un tavolino per stereomicroscopio in modo che il pesce sia orientato lungo l'asse laterale del suo corpo e sia il più piatto possibile.

La birifrangenza viene quindi visualizzata e l'integrità muscolare viene quantificata. Nella seconda fase del saggio di fuga evocata al tatto, una singola larva rivestita viene posta in una profonda capsula di Petri e poi centrata nel campo visivo dello stereomicroscopio. Uno stimolo meno sensoriale viene inviato alle larve toccando la coda con uno spillo da insetto e la reazione dell'animale viene ripresa fino a quando l'embrione smette di nuotare o nuota fuori dal campo visivo.

In definitiva, le differenze nell'organizzazione muscolare e nelle risposte locomotive possono essere quantificate. I principali vantaggi di queste tecniche non invasive sono che un gran numero di pesci può essere analizzato rapidamente e i difetti muscolari scheletrici nello stesso pesce possono essere monitorati in vivo per diversi giorni. Le dimostrazioni visive dell'installazione di lenti polarizzate e del posizionamento delle larve nell'orientamento corretto sono fondamentali per garantire il successo.

Con questi saggi, ripulisci le uova inviabili da tutte le covate raccolte dai pesci adulti in accoppiamento. Questi appaiono generalmente bianchi e opachi ad occhio nudo, o come un ammasso di cellule scure disorganizzate al microscopio, restituiscono gli embrioni all'incubatrice per un'ulteriore crescita da tre a sette giorni dopo la fecondazione. Se l'embrione di interesse rimane nel suo corion, usa un paio di pinze affilate per fare delicatamente uno strappo nel corion dell'embrione di interesse e poi capovolgilo in modo che l'embrione cada.

Anestetizzare gli embrioni rivestiti con trica per facilitare il loro corretto posizionamento e quindi montare un microscopio da dissezione con una lente polarizzata che può essere ruotata per regolare l'angolo della luce polarizzata. Una volta che gli embrioni si sono raddrizzati, posizionare una seconda lente polarizzata sul tavolino del microscopio direttamente sotto la lente superiore e posizionare gli embrioni direttamente sopra la seconda lente. Ogni embrione di interesse dovrebbe poi essere posizionato lungo l'asse laterale del suo corpo.

Ruotare la lente superiore con l'embrione di interesse in vista fino a quando l'asse di polarizzazione delle due lenti non è orientato di 90 gradi l'una dall'altra e lo sfondo è completamente scuro. Sposta i pesci per assicurarti che siano sdraiati il più distesi possibile. Se un pesce è curvo, solo i segmenti con un orientamento piatto passeranno la luce polarizzata e mostreranno per frt.

Ora, osservate il fenotipo bi frt del pesce di tipo selvatico. I muscoli scheletrici altamente organizzati mostrano una luminosità da frt poiché l'indice di rifrazione per la luce parallela ai filamenti myo è superiore alla luce polarizzata perpendicolare a queste strutture. I pesci con muscolo scheletrico disorganizzato, suggestivo di una miopatia neurodegenerativa o di un difetto dello sviluppo, mostrano tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza, i pesci con muscolo scheletrico disorganizzato.

Caratteristica della distrofia muscolare. Comunemente esibiscono un modello di birifrangenza simile a una macchia con aree scure che rappresentano la degenerazione muscolare tra le aree luminose della normale architettura muscolare. Raccogli immagini del pesce sotto luce polarizzata per quantificare la birifrangenza.

Salva le immagini come file tiff. Aprire le immagini di birifrangenza in un programma software di elaborazione delle immagini. Se si utilizza l'immagine J come mostrato qui per ogni immagine, per prima cosa, utilizzare lo strumento di selezione dei poligoni per tracciare una linea attorno al corpo del pesce per impostare l'area del muscolo del pesce zebra per la misurazione.

Quindi, nel menu a discesa Analizza, scegli Imposta misure per selezionare le statistiche richieste per l'immagine. Selezionare le caselle per il valore medio del grigio dell'area e il valore minimo e massimo del grigio per impostare il saggio del comportamento di fuga evocato al tatto da due a sette giorni dopo la fecondazione. Posizionare il pesce ricoperto di interesse singolarmente in piastre di Petri profonde lavorando con un solo embrione alla volta.

Centrare il pesce nel campo visivo di uno stereomicroscopio dotato di un sistema di fotocamera digitale e iniziare l'imaging sequenziale utilizzando frame rate maggiori o uguali a 30 hertz. Quindi, utilizzando uno spillo per insetti, toccare la coda dell'embrione per fornire lo stimolo meno sensoriale, interrompendo l'imaging quando l'embrione ha smesso di nuotare o ha nuotato fuori dal campo visivo. Infine, converti le immagini sequenziali in un file video o analizza i singoli fotogrammi delle immagini time-lapse.

La birifrangenza offline può essere utilizzata come un efficiente test non invasivo per far luce sullo stato dell'organizzazione miofibrillare negli embrioni di zebrafish viventi, il pesce zebra di tipo selvatico a cinque giorni dopo la fecondazione mostra muscoli scheletrici altamente frt sotto luce polarizzata a causa della loro serie ordinata di miofilamenti. Al contrario, gli embrioni di pari età omozigoti per una mutazione patogena nel gene del distro glicano o DAG one mostrano una birifrangenza irregolare indicativa di aree di degenerazione muscolare. Questo modello simile a una macchia e la rapida progressione della degenerazione muscolare durante lo sviluppo precoce sono coerenti con altri modelli di pesci distrofici.

Quantificando la birifrangenza di cinque giorni dopo la fecondazione, i mutanti distrofici DAG one identificano una significativa riduzione della luminosità a 27,9 più o meno il 5,3% della birifrangenza massima osservata nei loro fratelli wild type. Questa riduzione è più grave della riduzione a 52,4 più o meno il 5,5% osservata in tre giorni dopo la fecondazione mtm miopatico si morfine miopatiche I modelli di pesce tendono invece a mostrare una riduzione complessiva della birifrangenza rispetto al tipo selvatico, poiché spesso c'è una disorganizzazione miofibrillare nei principali muscoli scheletrici assiali, ma nessuna evidenza di cambiamenti degenerativi. I comportamenti di fuga permalosi e mirati possono essere utilizzati per dimostrare che i modelli di zebrafish di malattia del muscolo scheletrico mostrano difetti locomotori e difficoltà di nuoto.

Questo primo video mostra un saggio del comportamento di fuga evocato al tatto su un pesce zebra di tipo selvatico. Si noti come a cinque giorni dalla fecondazione, gli avannotti normali nuotano via molto rapidamente. In risposta al tocco in questo secondo video, è stato catturato il comportamento di fuga evocato dag one fry, il tocco evocato.

Si noti come gli embrioni mutanti del quinto giorno dopo la fecondazione mostrino una risposta compromessa al tatto e non riescano a uscire dal campo visivo dopo la stimolazione. I video sono stati poi analizzati fotogramma per fotogramma per confermare che i mutanti DAG one mostrano un movimento alterato rispetto ai controlli wild type in risposta a stimoli tattili. Le distanze che entrambi i tipi di embrioni sono stati in grado di percorrere entro un intervallo di tempo fisso sono state mediate e indicano una funzione motoria ridotta nei mutanti DAG one.

Una volta padroneggiate queste tecniche, possono essere eseguite su grandi quantità di pesce in un breve periodo, il che è fondamentale quando si eseguono screening chimici o di mutagenesi ad alto rendimento. A seguito di questa procedura, è possibile eseguire approcci più invasivi come l'immunoistochimica o la microscopia elettronica per studiare i difetti nel muscolo scheletrico a livello molecolare e strutturale.