Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Questo esperimento genera virus vaccinia ricombinanti marcati con fluorescenza attraverso un metodo modulare e rapido basato sulla selezione transitoria dominante. Per prima cosa, creare un vettore ricombinante contenente un marcatore fluorescente circondato da brevi regioni sintetizzate di omologia, nonché marcatori per la selezione metabolica e fluorescente. Trasfettare questo vettore di ricombinazione in cellule infette e amplificare i virus ricombinanti mediante selezione metabolica e fluorescenza. Successivamente, rimuovere la selezione metabolica per escindere il cassetta del marcatore e isolare le cellule contenenti virus ricombinanti mediante selezione del marcatore fluorescente. I risultati ottenuti dall'analisi delle placche virali su monociti cellulari permettono la visualizzazione di singole particelle virali caratteristiche del gene marcato con fluorescenza.

Abbiamo sviluppato questo metodo perché volevamo generare virus ricombinanti con molteplici modifiche genetiche, utilizzando un metodo di selezione applicabile in modo ripetuto e universale indipendentemente dal marcatore. Sebbene il principio della selezione transitoria dominante sia stato descritto in precedenza, abbiamo voluto applicarlo su scala più ampia e in maniera modulare, per ottenere maggiore flessibilità nelle modifiche genomiche. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la selezione e l'isolamento di placche virali ricombinanti possono risultare difficoltosi. La loro frequenza può essere bassa, e pertanto sono necessari alcuni metodi specifici per un recupero efficiente del virus.

Etichettare quindi il gene virale di interesse all'estremità N o C terminale della proteina. Di conseguenza, identificare regioni di omologia lunghe 150 paia di basi. Progettare poi una sequenza di oligonucleotidi costituita dai bracci sinistro e destro di 150 paia di basi, separati da una coppia di siti di restrizione a scelta. Delimitare inoltre questa regione da una seconda coppia di siti di restrizione diversi dalla prima coppia, per consentire l'inserimento nel vettore TDS una volta sintetizzato. Verificare ora che l'oligonucleotide con i siti di restrizione sia stato progettato in modo da essere in frame con il sito di inserimento desiderato. Per la sintesi dell'oligonucleotide, assicurarsi che i siti di restrizione inseriti tra i bracci sinistro e destro corrispondano a quelli che delimitano la sequenza codificante del marcatore fluorescente scelto. Inserire questi stessi siti di restrizione su entrambi i lati del marcatore fluorescente mediante PCR. Clonare il frammento sintetizzato nel vettore TDS. Clonare inoltre il marcatore fluorescente nel vettore di ricombinazione risultante, utilizzando i siti di restrizione compresi tra le regioni di omologia sinistra e destra. Infettare un monostrato di cellule BS-C-1 con il virus vaccinia in mezzo privo di siero.

Un'ora dopo l'infezione, recuperare le cellule con mezzo di Eagle modificato di Dulbecco. Trasfettare con una miscela di plasmide vettore per la ricombinazione e reagenti di trasfezione in un rapporto di tre a uno in mezzo privo di siero. Dopo 24 ore, raschiare e recuperare le cellule in DMEM contenente nessun siero bovino fetale. Sottoporre le cellule a tre cicli di congelamento e scongelamento per rompere le cellule e rilasciare le particelle virali. Successivamente, per ottenere un'adeguata separazione delle singole placche, infettare monociti cellulari di cellule BS-C-1 al 100% confluenti con diluizioni seriali della preparazione delle particelle virali. Sovrapporre con mezzo liquido contenente 10% FBS e DMEM più i reagenti di selezione GPT e incubare per 24 ore.

Aspirare il sovranatante liquido e utilizzare un microscopio a fluorescenza per cercare placche che mostrano una fluorescenza rossa diffusa, corrispondente all'incorporazione di M-cherry dal vettore TDS nel virus. A seconda del gene bersaglio e del marcatore fluorescente scelto, può essere osservata anche una fluorescenza localizzata del gene marcatore all'interno della stessa placca rossa.

Ora, per ciascun virus ricombinante, selezionare più placche, raschiare con la punta della pipetta e trasferire le cellule in una provetta Eppendorf aggiungendo 100 microlitri di DMEM contenente FBS al 5%. Eseguire tre cicli di congelamento e scongelamento delle cellule raschiate per liberare i virus ricombinanti.

Aggiungere il DMEM contenente il virus sottoposto a congelamento e scongelamento a un monostrato di cellule, in una piastra a 12 pozzetti, per amplificare i virus ricombinanti con reagenti di selezione GPT nel mezzo di crescita. Successivamente, raschiare le amplificazioni avvenute con successo a 24 ore post-infezione. Per un saggio di placche su placche amplificate con successo, che mostrano fluorescenza rossa, seminare una piastra a sei pozzetti con un monostrato di cellule BS-C-1.

Eseguire una diluizione seriale dei virus ricombinanti e infettare le pozzette con una diluizione crescente di virus in DMEM privo di FBS. Un'ora dopo l'infezione, rimuovere il mezzo liquido e sovrapporre ogni pozzetta con agarosio allo 0,5% in mezzo essenziale minimo completo. Tre giorni dopo l'infezione, isolare le placche che mostrano fluorescenza sia rossa sia del colore del marcatore fluorescente scelto.

Amplificare nuovamente questi senza selezione GPT. Scegliere le placche che hanno perso la fluorescenza rossa diffusa, ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al marcatore prescelto. Continuare la purificazione delle placche senza selezione per ottenere una scorta pura di virus ricombinanti che hanno perso i geni di selezione M-cherry e GPT, ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al marcatore scelto.

Valutare la purezza delle scorte mediante un saggio di placche, mirando a ottenere tutte le placche con un fenotipo simile. Amplificare le scorte virali di prova in un monostrato di cellule BS-C-1. Dopo 24 ore dal contagio, raschiare le cellule infette in 250 microlitri di DMEM. Centrifugare le cellule infette, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di SDS 0,1% in tampone TE. Vortexare per lisare le cellule. Quindi aggiungere 500 microlitri di fenolo, cloroformio, alcol isoamilico e capovolgere per mescolare. Centrifugare. Raccogliere la fase superiore e ripetere l'estrazione.

Quindi, per precipitare il DNA dallo strato acquoso, aggiungere un millilitro di etanolo freddo al 100% e 50 microlitri di acetato di sodio. Mescolare per inversione e collocare il campione a meno 20 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo aver centrifugato per formare il pellet di DNA, rimuovere tutto il liquido, essiccare il pellet di DNA all'aria e risospendere in 50 microlitri di tampone TE. Utilizzare questo template di DNA genomico per lo screening mediante PCR dell'inserzione virale. Generare virus ricombinanti con più marcatori come descritto nel protocollo testuale.

Questi virus vaccinia ricombinanti esprimono proteine marcate con marcatori fluorescenti diretti contro le proteine strutturali virali, A3 e F13, che fanno parte rispettivamente del nucleo interno e dell'involucro esterno del virus. Sono stati selezionati geni corrispondenti a proteine localizzate nel virione per visualizzare le particelle virali. A3 è una proteina del nucleo del virione vaccinia, mentre F13 è una proteina dell'involucro virale.

Viene mostrato anche un virus con doppia marcatura, con A3 e F13 entrambi fluorescentemente etichettati. È possibile eseguire microscopia a fluorescenza in tempo reale utilizzando un virus con doppia marcatura. In questo caso, la proteina del capside interno del virus vaccinia, A3, è etichettata in rosso, mentre la proteina dell'involucro esterno F13 è etichettata in verde.

Le particelle virali non avvolte provenienti dalla fabbrica virale sono visualizzate in rosso, mentre i virioni avvolti sono rappresentati dalla colocalizzazione dei canali rosso e verde. È stata utilizzata un'analisi quantitativa per determinare le efficienze di ricombinazione tra vettori ricombinanti e il genoma del virus vaccinia. L'efficienza di ricombinazione omologa tra vettori e il genoma del virus vaccinia può essere rilevata anche con regioni di omologia lunghe appena 70 paia di basi.

Questo metodo è stato utilizzato per creare virus con più marcatori fluorescenti e/o con eliminazioni multiple di geni. Questi virus sono stati impiegati nello studio del ciclo infettivo del virus, del ruolo delle proteine virali nella soppressione dei sistemi di difesa dell'ospite, nonché delle interazioni con i processi di segnalazione dell'ospite. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare virus vaccinia ricombinanti utilizzando un metodo modulare per i marcatori impiegati, accurato nella risoluzione dei ricombinanti desiderati e applicabile in diversi contesti di ricerca.