Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di offrire un metodo semplice e robusto per mappare e quantificare elementi organici e inorganici nei tessuti biologici con strumentazione da tavolo completamente compatibile con la microscopia ottica convenzionale. Ciò si ottiene concentrando un impulso laser sul campione di interesse per avviare la rottura e la scintilla del materiale. Il plasma emette radiazioni che vengono successivamente analizzate da uno spettrometro.

Il secondo passo consiste nel selezionare e identificare le linee spettrali corrispondenti agli elementi di interesse e scansionare la superficie del campione. Successivamente, eseguire le misurazioni di calibrazione per consentire la determinazione delle concentrazioni elementari. Il passo finale consiste nel costruire la mappatura elementare del tessuto campione da tutti gli spettri registrati utilizzando un'intensità relativa o una scala di concentrazione.

In definitiva, il laser ha indotto un guasto. La spettroscopia viene utilizzata per mostrare la distribuzione tissutale di vari elementi senza alcuna marcatura Rispetto ad altri metodi esistenti come la microfluorescenza a raggi X o le tecniche basate sulla spettroscopia di massa. La spettroscopia di rottura indotta da laser o labbra è semplice da implementare, funziona a pressione atmosferica ed è compatibile con la maggior parte dei sistemi di microscopio ottico.

Inoltre, permette di raggiungere il livello di sensibilità PPM con una risoluzione densa di micron. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nella nanotecnologia applicata agli studi biologici come la distribuzione all'interno di un campione di tessuto di nanoparticelle contenenti elementi metallici senza la necessità di marcatura delle nanoparticelle. La tecnica può estendersi alla patologia a causa del suo basso limite di rilevamento nel rilevare elementi metallici anormali come rame, ferro e alluminio che possono esistere in diversi organi del corpo, in particolare il cervello Attraverso questo metodo può fornire informazioni sul rilevamento e la lubrificazione delle nanoparticelle.

Può anche essere applicato ad altri sistemi come il rilevamento di elementi inorganici in TCU o la distribuzione di elementi eterogenei. Gli scienziati che dovranno condurre tali esperimenti dovranno lottare con le impostazioni di acquisizione per ottenere il maggior numero possibile di segnali senza danneggiare troppo i campioni. Iniziare l'esperimento preparando vetrini campione da studiare per questo protocollo.

Ottieni organi da topi portatori di tumore, iniettati con una soluzione di nanoparticelle di gadolinio per creare vetrini. Posizionare fette spesse 100 micrometri degli organi su un vetrino di quarzo o una capsula di Petri. Conservare sempre i vetrini a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Quindi, preparare i campioni per la calibrazione. Etichettare diverse fiale etichettate con le concentrazioni, iniziando da zero nanomolare e terminando a cinque millimolari. Per ogni fiala, preparare 100 microlitri di gadolinio in miscela acquosa con la concentrazione appropriata.

Fatto ciò, prepara una diapositiva. Misurare cinque microlitri dalla prima fiala e lasciarla cadere lungo il vetrino di quarzo o la capsula di Petri. Assicurati di identificare la goccia per un uso successivo.

Spostati di tre millimetri lungo la circonferenza e posiziona cinque microlitri della concentrazione successiva sul vetrino. Eseguire la stessa operazione per ciascuna delle soluzioni rimanenti. Asciugare il contenuto del vetrino per 20 minuti a temperatura ambiente.

Questa configurazione a labbro utilizza un laser al granato di alluminio ad atrio al neodimio a nanosecondi che produce un fascio di lunghezza d'onda di 1064 nanometri. Utilizzare parte del raggio per sincronizzare il sistema spettrometrico. Dirigere l'altra parte attraverso un attenuatore controllato da computer utilizzato per regolare e stabilizzare l'energia dell'impulso laser durante l'intero esperimento.

Quindi, dirigere il raggio verso la regione del campione. Focalizzare il raggio sullo stadio di traslazione controllato dal software. Ciò manterrà il supporto del campione una telecamera CCD per monitorare il montaggio della superficie del campione.

Un altro per monitorare il pennacchio di plasma. Analizza la luce proveniente dalla ripartizione del campione in uno spettrometro a rotazione con una telecamera ICCD mantenuta a una temperatura negativa di 26 gradi Celsius. Per la misurazione, iniziare a stabilizzare il laser e raffreddare la fotocamera a 26 gradi Celsius negativi.

10 minuti prima dell'esperimento. Quando si è pronti, utilizzare l'attenuatore per bloccare l'energia dell'impulso a cinque millijoule. Quindi, recupera un vetrino di esempio da studiare e preparati a montarlo sul tavolino di campionamento.

Fissare il campione sul portacampioni motorizzato. Fatto ciò, torna al computer. Per posizionare il campione, spostare il tavolino, in modo che una parte del campione si trovi nel raggio del laser.

Regolare la messa a fuoco del laser a circa 100 micrometri sotto la superficie del campione. Fatto ciò, il laser forma crateri di 50 micrometri o meno. Utilizzare il computer per impostare il valore della fessura di ingresso dello spettrometro su 40 micrometri e i parametri ICCD per la misurazione della mappatura.

Regolare la posizione del supporto per mirare a una regione del campione. Acquisire un'immagine panoramica ad alta risoluzione del campione con una sorgente luminosa ad ampio spettro. Quindi utilizzare il software e l'immagine acquisita per definire la regione di scansione e la risoluzione delle librerie.

Qui la griglia è 100 per 100 con 100 micrometri tra i punti. Avvia l'acquisizione automatizzata dei dati in ogni punto della griglia. Uno spettro viene misurato e registrato su file.

Quando le misurazioni sono state effettuate in circa 30 minuti, scattare una seconda immagine della fetta di campione, quindi consolidare tutti gli spettri in un unico file di dati per un uso successivo. Quindi, rimuovere il vetrino del campione e prepararsi a montare i campioni di calibrazione. Fissare il vetrino di quarzo con i campioni di calibrazione sul tavolino di traslazione al computer.

Posizionare il centro del primo campione di calibrazione nel percorso del laser. Mantenere i parametri dell'esperimento e registrare uno spettro. Fai lo stesso per ciascuno dei diversi campioni di concentrazione di gadolinio.

Questi sono esempi di spettri a colpo singolo registrati da diverse regioni del tessuto renale. Lo spettro blu è stato registrato nella regione centrale del rene. Lo spettro rosso corrisponde alla membrana renale e lo spettro verde è per l'area periferica.

Le nanoparticelle iniettate a base di gadolinio sono composte da una matrice di polilaano con ione gadolinio chelato da legante doca sulla loro superficie. Nell'intervallo spettrale da 286 nanometri a 320 nanometri utilizzati possono essere rilevati gadolinio, calcio, ferro, silicio e alluminio. Si noti come le intensità variano nelle diverse regioni del campione, suggerendo una grande eterogeneità di queste concentrazioni di elementi nella mappatura tissutale di gadolinio, silicio e ferro in una fetta di rene di topo è stata effettuata utilizzando i dati di libs con una risoluzione di circa 100 micrometri.

L'intensità della scala è espressa in un'unità arbitraria. Questa è un'immagine a luce naturale. Per confronto, risultati simili sono stati ottenuti con campioni di tumore.

Come per questa mappa del tessuto tumorale del gadolinio e del SQ 20 B, una scala di falsi colori è stata sovrapposta all'immagine della luce naturale. Per questo esperimento, le nanoparticelle sono state somministrate direttamente nel tumore. Dopo un'ora, il tumore è stato rimosso e preparato per l'analisi.

Si noti che circa la metà del volume tumorale contiene alcune particelle On masters. Questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora per campioni di un centimetro quadrato con una risoluzione di 100 micrometri se eseguita correttamente. Quando si eseguono le labbra, è importante ricordare che le misurazioni vengono eseguite da plasma indotto da laser ed è fondamentale controllare tutti i parametri durante l'intero esperimento successivo alla procedura.

Altri metodi possono essere eseguiti come l'immunoistochimica su fette adiacenti per rispondere a ulteriori domande come il tipo di cellula coinvolta nel processo di interesse dopo il suo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle nanotecnologie applicate alla biologia e alla medicina per esplorare la distribuzione di composti contenenti elementi metallici nei tessuti biologici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche delle labbra per mappare i multielementi nei tessuti biologici.