Un protocollo per l'analisi dell'epatite C replicazione del virus

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le diverse fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Questo viene ottenuto innanzitutto generando trascritti di RNA genomico di HCV a partire da costrutti plasmidici di HCV linearizzati. Il secondo passaggio consiste nel trasfettare le cellule con H-C-V-R-N-A. Successivamente, le cellule vengono seminate per diversi punti temporali e sottoposte a vari saggi. L'ultimo passaggio prevede la raccolta del supernatante della coltura cellulare per la misurazione del titolo virale e il recupero delle cellule trasfettate per l'estrazione di proteine e RNA. Infine, vengono eseguiti la retrotrascrizione-PCR, il Western blot, il saggio di immunofluorescenza e la determinazione del titolo di HCV, dimostrando così un sistema robusto di coltura cellulare infettiva per HCV.

Il principale vantaggio di questo sistema di coltura cellulare del virus dell'epatite C infettivo rispetto al sistema di replicone dell'HCV è che possono essere studiati i passaggi di entrata virale, assemblaggio del virione e fuoriuscita. Questo protocollo può aiutare a rispondere alle domande fondamentali nel campo della virologia dell'epatite C, come la morfogenesi del virione e l'interazione tra patogeno e ospite. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di vaccini, poiché consente la caratterizzazione di ceppi virali attenuati che possono essere valutati come possibili candidati vaccinali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul virus dell'epatite C, può essere applicato anche ad altri virus a RNA della famiglia dei Flaviviridae. In generale, le persone nuove a questo metodo dovranno affrontare la sfida di generare un RNA genomico di HCV di alta qualità. Lo studio dell'intero ciclo replicativo dell'HCV è diventato possibile in coltura cellulare dopo la scoperta di un ceppo giapponese di epatite fulminante di genotipo 2A dell'HCV. La dimostrazione visiva del saggio virologico è fondamentale poiché il saggio richiederà competenze sia nelle tecniche molecolari che cellulari.

Utilizzando un virus chimera intragenotipo 2A, F-N-X-H-C-V e F-N-X-H-C-V privo di polimerasi per la valutazione della replicazione virale, linearizzare i plasmidi virali precedentemente generati mediante digestione con l'enzima di restrizione XBA-uno in un tubo da due millilitri. Successivamente, trattare i plasmidi con la nuclease di mung bean per generare estremi ottusi.

Purificare i plasmidi digeriti mediante cromatografia a scambio anionico. Verificare l'integrità del plasmide linearizzato sottoponendo il DNA a elettroforesi su gel di agarosio. Successivamente, aggiungere il plasmide linearizzato come stampo di DNA in una provetta da 0,2 millilitri contenente i componenti della reazione della RNA polimerasi T-sette per sintetizzare trascritti di RNA genomico dell'HCV.

Purificare l'RNA appena sintetizzato e trattato con DNasi utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Successivamente, verificare la produzione di RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio. Dopodiché, quantificare l'RNA mediante spettrofotometria.

Staccare le cellule aderenti di tipo Huh-7 mediante trattamento enzimatico con tripsina e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo due successive centrifugazioni, risospendere il pellet cellulare in mezzo con basso contenuto di siero freddo. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, risospendere le cellule in mezzo con basso contenuto di siero a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule per millilitro.

Successivamente, mescolare un totale di 10 microgrammi di RNA virale trascritto con 400 microlitri di cellule risospese in una cuvetta di elettroporazione preraffreddata da 0,4 centimetri. Introdurre l'RNA virale nelle cellule mediante elettroporazione a 270 volt, 100 ohm e 950 microfarad. Al termine, risospendere le cellule elettroporate in 10 millilitri di terreno di crescita completo con 15% di FBS. A questo punto, seminare le cellule sia in fiasche T25 a circa 1,2 × 10⁶ cellule per fialca sia in piastre a 48 pozzetti a 1 × 10⁴ cellule per pozzetto, per i tempi di 4, 48 e 96 ore. Sostituire il terreno dalle quattro alle otto ore dopo la trasfezione con terreno di crescita fresco supplementato con 10% di FBS, per rimuovere i detriti cellulari morti dalle fiasche e piastre coltivate.

Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere i supernatanti della coltura cellulare ai tempi di 48 e 96 ore in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, rimuovere i detriti cellulari dai campioni raccolti mediante centrifugazione a 15.000 rpm per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, conservare i supernatanti privi di cellule a meno 80 gradi Celsius.

Lisare le cellule per l'analisi di proteine e RNA mediante western blot e PCR quantitativa con trascrittasi inversa o RT-qPCR ai tempi indicati. Trascrivere al contrario un microgrammo di RNA cellulare totale utilizzando l'enzima trascrittasi inversa e un primer specifico per il filamento senso dell'HCV che si lega alla regione non tradotta a cinque primi in un tubo da 0,2 millilitri. Trascrivere inoltre F-N-X-H-C-V-R-N-A con numero di copie genomiche noto utilizzando un primer per il filamento senso dell'HCV. Mediante un sistema di PCR in tempo reale, eseguire la qPCR utilizzando 50 nanogrammi del cDNA trascritto risultante, impiegando primer specifici per l'HCV e una miscela super qPCR contenente un colorante verde legante del DNA. Utilizzare le seguenti condizioni durante l'esecuzione della qPCR per determinare il numero di copie di H-C-V-R-N-A. Dopo la qPCR, risolvere il lisato cellulare ottenuto dalla transfezione di RNA virale a 96 ore post transfezione mediante elettroforesi SDS-PAGE. Successivamente, trasferire le proteine risolte nel gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene mediante metodo trans-blot turbo. Bloccare la membrana utilizzando una soluzione di bloccaggio contenente latte scremato al 5% e tween-20 allo 0,2% in PBS, posizionandola in un contenitore.

Incubare la membrana con l'anticorpo monoclonale murino primario NS3 in una diluizione di uno a 1000 e con beta-actina in una diluizione di uno a 5.000 in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere immunoglobulina G anti-topo da capra coniugata con perossidasi di rafano in una diluizione di uno a 5.000 e rivelare mediante chemiluminescenza.

A questo punto, fissare le cellule trasfettate con H-C-V-R-N-A utilizzando metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius per il saggio di immunofluorescenza. Al termine, lavare le cellule con PBS per tre volte. Dopo il blocco con il buffer bloccante per saggio di immunofluorescenza, utilizzare l'anticorpo primario policlonale anti-NS5A da coniglio e l'anticorpo monoclonale da topo anti-DSRNA J2 in un rapporto di diluizione di uno a 200 e incubare per cinque ore fino all'indomani in una stanza fredda a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l'anticorpo primario. Successivamente, aggiungere l'anticorpo secondario policlonale caprino anti-immunoglobulina-G 488 da coniglio e l'anticorpo secondario policlonale caprino anti-immunoglobulina 594 da topo in un rapporto di diluizione di uno a 1000 e incubare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore da banco. Dopo aver lavato le cellule con PBS per tre volte, colorare i nuclei utilizzando il colorante Hoechst e osservare al microscopio a fluorescenza.

Piastrare successivamente cellule Huh7.5.1 naive a circa tre volte 10 alla terza cellule per pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, effettuare una diluizione seriale decimale del supernatante di coltura privo di cellule, raccolto da cellule trasfettate con H-C-V-R-N-A, utilizzando il mezzo di crescita e inocularlo in triplice copia su cellule Huh7.5.1. Fissare le cellule a 72 ore post-infezione utilizzando metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius. Dopo aver rimosso le cellule dal congelatore, eseguire la colorazione per la proteina NS5A dell'H-C-V nelle condizioni precedentemente descritte. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, contare i focolai cellulari positivi per NS5A nel pozzetto con la diluizione virale più elevata e calcolare il numero medio di unità formanti focolai per millilitro.

La qualità del plasmide lineare dell'HCV è stata valutata mediante elettroforesi su gel. L'H-C-V-D-N-A è stato sottoposto a trascrizione in vitro mediata dalla RNA polimerasi T-sette, che ha prodotto un singolo prodotto di RNA di 9,6 chilobasi. I risultati della RT-qPCR hanno indicato che il virus di tipo selvaggio replica il genoma in modo efficiente. Il tipo selvaggio ha mostrato un livello di replicazione del genoma da uno a tre logaritmi più elevato rispetto al virus pol-null.

Il virus di tipo selvaggio ha prodotto la proteina NS3 coinvolta nel taglio delle proteine virali e nella replicazione del genoma. Il virus di tipo selvaggio ha inoltre espresso la proteina NS5A e la proteina NS5A e l'RNA a doppio filamento si sono co-localizzati nel citoplasma cellulare delle cellule trasfettate con il tipo selvaggio, suggerendo una replicazione virale attiva. Le misurazioni del titolo virale hanno indicato che il virus di tipo selvaggio è infettivo e produce oltre 10.000 unità formanti focolai per millilitro di particelle infettive. A sei ore dal transfezione, sia il virus di tipo selvaggio che il virus pol-null hanno mostrato attività simili della luciferasi, indicando un livello simile di traduzione dell'RNA trasfettato. Tuttavia, a 48 e 96 ore dal transfezione, il virus di tipo selvaggio ha mostrato livelli di replicazione del genoma superiori rispetto al virus pol-null. Il virus di tipo selvaggio ha inoltre prodotto la proteina virale NS3. Il virus poll null ha mostrato un'attività basale della luciferasi, mentre il virus di tipo selvaggio ha mostrato un livello di replicazione da due a tre log superiore rispetto al virus reporter pol-null. Una volta padroneggiati, i saggi virologici per l'epatite C possono essere eseguiti in due settimane se effettuati correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale disporre di cellule robuste e di trascritti di RNA genomico HCV di alta qualità. Dopo questa procedura, ceppi di HCV caratterizzati possono essere testati in sistemi modello animale per indagare la fitness in vivo e le interazioni tra ospite e patogeno.

Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare infettivo per l'HCV ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare i passaggi della morfogenesi del virione e dell'uscita virale nel ciclo di replicazione dell'HCV. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire vari saggi virologici per caratterizzare le diverse fasi del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite C può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni di sicurezza, come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, durante l'esecuzione di questa procedura.