BEST: Barcode Enabled Sequencing di tetradi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un gran numero di progenie ricombinante da un incrocio di lievito in modo da conservare le informazioni su quale progenie è derivata dalla stessa tetrade originale. Ciò si ottiene trasformando prima il ceppo diploide eterozigote da utilizzare nell'incrocio con una libreria plasmidica che contiene un codice a barre tetraspecifico e un reporter fluorescente specifico per la sporulazione. Il secondo passo consiste nel trasferire le cellule con codice a barre nel mezzo di sporulazione.

Ciò consente la formazione dei tetra e induce l'espressione del reporter fluorescente GFP nei tetra, ma non nelle cellule che non riescono a sporulare. Successivamente, uno smistatore fax separa i tetra marcati in fluorescenza dalle altre cellule e li deposita direttamente in una piastra di agar dove il rivestimento esterno dei tetra viene digerito enzimaticamente. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare perle di vetro per separare e diffondere le spore dei tetra digeriti sulla superficie della piastra di agar, consentendo a ciascuna spora di formare una singola colonia.

Infine, i ceppi ottenuti con questo metodo saranno genotipizzati utilizzando un protocollo di sequenziamento del DNA multiplex ad alto rendimento che leggerà il codice a barre tetra specifico di ciascun ceppo. I codici a barre vengono quindi utilizzati per identificare ciascuno dei quattro ceppi risultanti da un singolo evento miotico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la dissezione manuale a secco di Ted con un micro manipolatore, è che un ricercatore può isolare diverse migliaia di progenie ricombinante in poche ore.

Le cellule di lievito diploidi utilizzate in questo studio sono state precedentemente trasformate con una libreria di plasmidi con codice a barre come descritto nel manoscritto di accompagnamento e conservate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per far rivivere le cellule dagli steli congelati. Coltivali durante la notte in cinque millilitri di YPD più 200 microgrammi per millilitro G quattro 18 a 30 gradi Celsius con agitazione il giorno successivo. Lavare le cellule dalle colture notturne tre volte in PBS e quindi risospendere le cellule fino a un volume finale di due millilitri in terreno di sporulazione, più 200 microgrammi per millilitro.

G quattro 18 Agitare le colture di sporulazione a temperatura ambiente. Monitora quotidianamente l'andamento della sporulazione fino a quando nuove tetrade non hanno smesso di formarsi. In genere, questo richiede da due a quattro giorni una volta che le colture contengono tetrade ben formate e relativamente poche diadi.

Togliere le colture dall'agitazione e lasciarle a temperatura ambiente per almeno sette giorni prima della cernita della tetrade. L'aspetto più difficile di questa procedura è ottenere una buona separazione delle spore. Abbiamo scoperto empiricamente che lasciare che le colture sporulate rimangano a temperatura ambiente senza agitazione per almeno una settimana prima della selezione della tetrade migliora notevolmente la separazione delle spore.

Le tetradi della coltura di sporulazione possono essere rilevate e isolate mediante smistamento cellulare attivato a fluorescenza o fax perché i plasmidi con codice a barre nelle cellule diploidi trasportano anche una proteina di fusione GFP specifica per la sporulazione. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per un fax aria a due. Per iniziare questa procedura, caricare la coltura sporulata sullo smistatore fax e impostare due porte di dispersione in avanti e laterali per escludere detriti, cellule raggruppate e più cellule per gocciolina.

Dovrebbe esserci una popolazione di cellule fluorescenti, che quando si utilizza il costrutto reporter PS a due GFP include diadi e tetradi andatura, la GFP contro FSC per includere questi eventi fluorescenti. A seconda del background del ceppo, potrebbe essere necessario includere un'andatura aggiuntiva per rimuovere i grumi che includono tetra e altre cellule. Ispezionare un istogramma FSC degli eventi fluorescenti.

In questo esempio, gli eventi nel picco sinistro sono principalmente tetra e gli eventi nel picco destro sono generalmente tetra con un bocciolo attaccato che applica un gate finale che include eventi con FSC inferiore che sono per lo più tetra indicati dalle barre rosse. Verificare l'efficienza del regime di gating ordinando circa 1.500 tetra su un vetrino da microscopio e contando la proporzione tra tetradi e non tetradi. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte, la percentuale di tetradi può essere stimata con precisione contando solo circa 200 eventi ordinati, ma l'ordinamento di circa 1.500 riduce la quantità di tempo impiegato per la ricerca di cellule sul vetrino del microscopio.

Queste immagini in campo chiaro aggiungono un ingrandimento di 600 volte. Mostra esempi di tetrade a sinistra e non tetrade a destra dopo l'ordinamento dei fatti. Controllare periodicamente che la selezionatrice riporti accuratamente il numero di eventi ordinando 25 tetra su un vetrino da microscopio ed esaminando le cellule contenute nella gocciolina utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 400 volte.

Dovrebbero esserci 25 tetradi nella gocciolina. Ripetere l'operazione tre o quattro volte per valutare la varianza dello strumento fax in quella seduta. Preparare le piastre di agar per questa procedura riscaldando il numero desiderato di YPD più G quattro piastre da 18 per almeno 1,5 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius posizionata vicino allo smistatore fax.

Una caratteristica chiave del protocollo di smistamento è la capacità di indirizzare con precisione le tetrade smistate via fax a una posizione specifica su una piastra di agar che contiene un pool di soluzione X. Per fare ciò, posizionare prima una piastra a 96 pozzetti sull'unità di deposizione automatizzata della cella di smistamento. Quindi, prepara un layout di ordinamento che ordinerà 25 tetra in un pozzetto di 96.

La selezione di 25 tetra per piastra produce colonie ben separate. Scegli un pozzetto vicino al centro della piastra. Ad esempio, bene D cinque.

Portare una pila di 10 piastre di agar dall'incubatore a 37 gradi Celsius alla selezionatrice. Prelevare una piastra di agar e pipettare 25 microlitri di soluzione di zy sull'agar vicino al centro della piastra. Quindi posizionare la piastra sulla piastra a 96 pozzetti, allineando la gocciolina X sul bersaglio.

Beh, questo è stato scelto prima. Beh, D cinque. Iniziare lo smistamento e depositare 25 tetra al centro della gocciolina di zy sulla piastra di agar.

Togliete e coprite il piatto. Ripetere lo smistamento per ogni piastra fino a quando 25 tetrade sono state ordinate in goccioline di zamo su ogni piastra della pila. Rimetti la pila di piastre contenenti tetra nell'incubatore a 37 gradi Celsius.

Portare la prossima pila di 10 piastre allo smistatore e ripetere la procedura di smistamento. Le spore possono essere separate dopo che la tetrade contenente piastre di agar è stata incubata a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Per iniziare questa procedura, aggiungere da 15 a 25 perle di vetro sterili da tre millimetri a ciascuna piastra e agitare le piastre come due pile di cinque piastre per tre o cinque minuti.

La migliore separazione delle spore si ottiene spostando rigidamente le piastre da un lato all'altro o dalla parte anteriore a quella posteriore. Non spostare le piastre in modo tale che le perline turbinino attorno al bordo esterno della piastra. Lasciare le perline sui piatti quando hanno finito.

Posiziona la pila di piatti con le perline rivolte verso l'alto in un'incubatrice a 30 gradi Celsius. Recupera la prossima pila di piastre dall'incubatrice a 37 gradi Celsius e ripeti la procedura di separazione delle spore usando le perline. Incubare tutte le piastre per una notte a 30 gradi Celsius il giorno dopo aver separato le spore.

Rimuovere con cautela le piastre dall'incubatrice a 30 gradi Celsius senza disturbare le perle di vetro. Piccole colonie dovrebbero essersi formate sulle piastre. Rimuovere le perle di vetro capovolgendo con cura e rapidamente le piastre su un contenitore profondo.

Battere il fondo della piastra mentre è capovolta può aiutare a rimuovere le perline che sono attaccate alla piastra. I contenitori devono essere abbastanza profondi da raccogliere le perline senza permettere loro di rimbalzare e colpire la piastra di agar. Conta il numero di colonie su ogni piastra e usa il numero di colonie per stimare l'efficienza della separazione e del recupero delle spore.

Ad esempio, 25 tetrade per piastra per un incrocio con una vitalità vicina al 100% potrebbero produrre un totale di 100 colonie per piastra da piastre con un numero sufficiente di colonie, ad esempio superiore a 65 per un'elevata vitalità. Cellule di trasferimento incrociato da ciascuna colonia in un pozzetto separato di una piastra da 96 pozzetti contenente il liquido YPD più G quattro 18. Prendi nota anche di quali pozzetti contengono colonie dalla stessa piastra di agar.

Queste informazioni verranno utilizzate in seguito per facilitare l'assegnazione dei tetra. Il software può migliorare notevolmente la velocità con cui le spore delle tetrade possono essere isolate. Sebbene l'attuale iterazione del metodo abbia una certa perdita di efficienza rispetto alla dissezione manuale, la distribuzione binomiale è stata utilizzata per calcolare la frazione attesa di tetradi con almeno una spora recuperata con successo che produce 1, 2, 3 o quattro colonie in base alla proporzione di tutte le spore recuperate con successo.

Questo grafico può servire come guida approssimativa al numero di ceppi che alla fine verranno assemblati in tre o quattro tetra di spore, come osservato qui. Il numero di tetra completi recuperati aumenta all'aumentare del numero di colonie per piastra in questo studio. 25 rad provenienti da tutto con una vitalità di spore vicina al 100% come dissezione manuale determinata sono stati placcati su 149 piastre di agar.

Il numero massimo di colonie osservate per piastra è stato di 80, indicando che 20 spore non sono riuscite a formare colonie discrete. Il numero medio di colonie per piastra è stato di 62 4, 354 colonie da 61 piastre contenenti 65 o più colonie sono state raccolte e sequenziate. Dei 3.700 ceppi che hanno superato il controllo di qualità del sequenziamento, 2.665 o il 72% potrebbero essere assegnati computazionalmente in tre o quattro tetrade di spore Una volta padroneggiati.

Questa tecnica può essere utilizzata per elaborare più di mille tetrade all'ora. Anche se per precisioni superiori a tre ore, avrai bisogno di assistenza.