Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto
21 febbraio 2014
Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare vescicole a doppio strato fosfolipidico con un maggiore controllo sulla membrana, l'unla, la molarità, la monodispersità e il contenuto interno. Utilizzando il cad, una camera è realizzata con fogli acrilici e gomma naturale. Un doppio strato lipidico sospeso viene prodotto caricando la camera con lipidi e soluzione.
Successivamente, un getto d'inchiostro contenente la soluzione da incapsulare viene impostato con l'apparato a getto. Una volta stabilite le impostazioni appropriate, gli impulsi di fluido a getto produrranno vescicole a doppio strato lipidico. In definitiva, il getto microfluidico produce vescicole a doppio strato monodisperse ripetibili.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettroformazione, l'emulsione o la generazione di goccioline, è l'aumento del livello di controllo che governa la membrana, la molarità unilaterale, la monodispersità e il contenuto interno. A dimostrare la procedura sarà Johanna Harrow, una studentessa laureata di un laboratorio e ad assistere sarà Kara Patel, una studentessa universitaria Utilizzando il software CAD, disegnare una forma per la camera che può essere realizzata in acrilico utilizzando un primo trapano da taglio laser, un foro passante da 16 pollici su entrambi i lati della camera acrilica assemblata. Questo drenerà nel pozzo a forma di infinito.
In secondo luogo, taglia un piccolo rettangolo con le forbici da un foglio acrilico di 0,2 millimetri per fungere da fondo a forma di infinito. Fissalo bene in posizione con l'adesivo ad asciugatura rapida, assicurandoti di non far entrare la colla nelle aree di visualizzazione. Il foglio acrilico deve essere lavato sulla parete della camera e fissato al fondo della camera.
In terzo luogo, utilizzare un adesivo ad asciugatura rapida per incollare un sottile pezzo di foglio di gomma naturale sui fori praticati. Premerli in posizione con una pinzetta. Verifica che tutte le cuciture incollate non presentino perdite.
Non dovrebbero essercene alcuno. Infine, utilizzando un ago calibro 23, praticare dei fori nella gomma attraverso i fori praticati, la punta del getto d'inchiostro piezoelettrico verrà inserita attraverso questi fori. I fosfolipidi di riserva devono essere disciolti in cloroformio e conservati a meno 20 gradi Celsius.
D-P-H-P-C o DOPC. In questa dimostrazione vengono utilizzati i lipidi. I lipidi disciolti nel cloroformio vengono trasferiti in una fiala di vetro tenendo la fiala inclinata, asciugando delicatamente i lipidi sotto argon o azoto gassoso.
Quindi posizionare il flaconcino con il tappo leggermente allentato sotto vuoto per una o due ore per rimuovere il solvente residuo. Per questa fase è possibile utilizzare anche un essiccante. Ora solubilizzare i lipidi in end decking per una concentrazione lipidica finale di 25 milligrammi per millilitro.
Vortex la soluzione. Sigillare brevemente il tappo con param e poi sonicare per 15 minuti. Conservare questa soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Successivamente, preparare una soluzione stock di saccarosio con osmolarità fisiologica. Questa è la soluzione a getto. Prendi in considerazione l'aggiunta di una goccia di colorante alimentare scuro o perline fluorescenti alla soluzione per un maggiore contrasto o fluorescenza.
Caricare la soluzione di saccarosio in una siringa da un millilitro per rimuovere l'aria intrappolata. Muovi la siringa in modo che eventuali bolle salgono all'apertura dell'esca e possano essere espulse. Quindi, collegare un filtro da 33 millimetri da 0,22 micron alla siringa e spingere fuori una goccia attraverso il filtro.
Ora svita l'adattatore per esca femmina del getto d'inchiostro e premilo sull'estremità del filtro. Espellere un po' di liquido per rimuovere l'aria intrappolata. Infine, collegare la siringa alla parte superiore del fluido a getto d'inchiostro.
Dovrebbe viaggiare fino alla punta del getto d'inchiostro se la siringa è stata collegata correttamente. Per prima cosa, montare il gruppo siringa sul tavolino del microscopio e collegare il controller a getto d'inchiostro per questo esperimento. Il tavolino e la siringa necessitano di un controllo indipendente con il tavolino e la siringa che si muovono entrambi in tre dimensioni per la visualizzazione.
Configura una telecamera ad alta velocità in grado di raggiungere almeno 1000 fotogrammi al secondo. Impostalo per utilizzare l'attivazione automatica basata su immagini per avviare le registrazioni. Ora, fissa la camera al tavolino con del nastro adesivo e allinea accuratamente la punta a getto d'inchiostro con il foro praticato nel foglio di gomma sul lato della camera.
Per prima cosa, regolare a occhio e poi effettuare regolazioni fini utilizzando il microscopio. Una volta allineata, estrarre la siringa lungo una dimensione per caricare la siringa a forma di infinito. Bene, quindi applica una leggera pressione sullo stantuffo, in modo che si formi una gocciolina sull'ugello.
Questo fornisce una certa contropressione iniziale. I parametri di getto devono essere impostati. Successivamente, i valori specifici per un'onda bipolare trapezoidale sono presentati sullo schermo, la tensione applicata e il numero di impulsi del getto per dimensione della vescicola di controllo del grilletto.
Ora caricare la camera con 25-30 microlitri di soluzione lipidica alla fine del decennio, coprendo l'intera superficie della forma all'infinito. Bene quindi a ciascuno, aggiungere bene 25 microlitri di soluzione di glucosio al bordo più esterno pipettando lentamente e senza intoppi, il glucosio non deve mescolarsi alla soluzione lipidica. Entro 10 minuti, si formerà un doppio strato lipidico al centro della camera.
L'impostazione del doppio strato è il passaggio più critico poiché il doppio strato è instabile e può rompersi a seconda della preparazione. Sii paziente. Funzionerà una volta che ti eserciterai a riempire la camera un paio di volte.
Ora, reinserire con cautela la punta a getto d'inchiostro nella camera quando la punta si trova entro 200 micron dall'interfaccia delle gocce. Il doppio strato, l'avvio del processo di getto e la registrazione dei dati utilizzando il getto d'inchiostro hanno fornito informazioni dettagliate sul processo di generazione delle vescicole. Ad esempio, la variazione della distanza tra l'ugello a getto d'inchiostro e il doppio strato lipidico ha influenzato la forza che deforma la membrana. Chiudere.
La vicinanza al doppio strato focalizzava la corrente a getto e impediva alla membrana di disperdere energia lontano dal punto di generazione delle vescicole. Inoltre, la corsa del vortice aumentava con la tensione applicata all'attuatore elettrico pizo. La formazione delle vescicole è stata visualizzata come una sequenza di eventi successivi alla loro formazione.
La stabilità delle vescicole tendeva a variare con il diametro delle vescicole, con le vescicole più piccole più stabili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare vescicole violatrici lipidiche usando il getto microfluidico.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per la generazione di vescicole a doppio strato fosfolipidico mediante microfluidica a getto su un doppio strato lipidico all'interfaccia di una goccia. La tecnica consente un controllo preciso sull'asimmetria della membrana, sull'incorporazione di proteine transmembrana e sul confinamento di materiali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Biotecnologia
Sfondo
- Le vescicole a doppio strato di fosfolipidi sono essenziali per lo studio di biomolecole compartimentalizzate.
- Le tecniche microfluidiche migliorano la riproducibilità e il controllo della formazione delle vescicole.
- Comprendere le proprietà della membrana è fondamentale per numerose applicazioni biologiche.
- La tecnologia jetting può semplificare il processo di generazione delle vescicole.
Scopo dello studio
- Generare vescicole con caratteristiche della membrana controllate.
- Facilitare l'incorporazione di proteine specifiche nel doppio strato lipidico.
- Permettere l'incapsulamento di vari materiali a fini di ricerca.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di una camera utilizzando fogli di acrilico e gomma naturale.
- Formazione di un bilayer lipidico sospeso caricando la camera con lipidi e soluzione.
- Preparazione di un apparato a getto d'inchiostro per l'incapsulamento di soluzioni.
- Definizione delle condizioni ottimali per gli impulsi di fluido erogati tramite getto al fine di generare vescicole.
Risultati principali
- La microfluidica a getto produce vescicole bicamerali mono-disperse riproducibili.
- Il metodo consente un controllo preciso sulle proprietà delle vescicole.
- L'incapsulamento dei materiali viene effettuato in modo efficace.
- Le vescicole possono essere modulate per diversi studi biologici.
Conclusioni
- La microfluidica a getto è una tecnica affidabile per la generazione di vescicole.
- Il controllo sull'asimmetria della membrana e sull'incorporazione di proteine è potenziato.
- Questo metodo ha implicazioni significative per lo studio di biomolecole compartimentalizzate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'uso del microjetting consente un controllo preciso sulla generazione di vescicole a doppio strato lipidico, favorendo la produzione riproducibile di vescicole unilamellari giganti (GUVs) con composizione della membrana definita e capacità di incapsulamento. Questa capacità risolve una sfida fondamentale nella ricerca in biologia sintetica e nel rilascio di farmaci, fornendo una piattaforma regolabile per la modellizzazione di sistemi cellulari e la sperimentazione di composti bioattivi. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella validazione precoce dei bersagli, consentendo un'analisi sistematica di processi dipendenti dalla membrana.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il controllo dell'asimmetria della membrana e l'incorporazione di proteine transmembrana.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli generando sistemi di vescicole riproducibili per la chiarificazione dei percorsi biologici.
- Valore predittivo: Facilita la selezione di portafogli fornendo letture quantitative sulle interazioni lipide-proteina e sull'efficienza di incapsulamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi producendo vescicole mono-disperse con dimensioni e contenuto interno regolabili.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità dei saggi attraverso parametri di jetting precisi che controllano la formazione delle vescicole.
- Prontezza per lo screening: Mette in evidenza la scalabilità e la riutilizzabilità della piattaforma per la valutazione affidabile di composti in diverse condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza per le malattie attraverso l'uso di soluzioni con osmolarità fisiologica e il tracciamento fluorescente per il monitoraggio delle vescicole.
- Allineamento Preclinico: Descrive la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, consentendo l'incapsulamento di candidati terapeutici per studi sulla stabilità e sul rilascio.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta il processo decisionale fornendo risultati misurabili sulla stabilità delle vescicole e sulle prestazioni dipendenti dal diametro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale delle ipotesi all'identificazione del composto guida, in particolare nei saggi che richiedono ambienti di membrana controllati e il rilascio di composti incapsulati.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi permettendo una variazione sistematica della composizione lipidica e l'incorporazione di proteine transmembrana per chiarire le dipendenze dei percorsi.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la generazione di vescicole mono-disperse che garantiscono un'esposizione costante ai composti e letture riproducibili.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni quantitative come la dimensione delle vescicole, la velocità di formazione e l'efficienza di incapsulamento, che aiutano i gruppi a confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica consentendo l'incapsulamento di farmaci o biomolecole per test di stabilità e profili di rilascio.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, adattabile a diversi progetti che richiedono piattaforme di vescicole sintetiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei meccanismi legati alle membrane.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della produzione di vescicole per applicazioni ad alto rendimento.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce dei rischi associati ai meccanismi di somministrazione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate sui dati di prestazione delle vescicole.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, manipolazione dei lipidi e microscopia per il montaggio della camera e la formazione del doppio strato lipidico.
- Richiede strumentazione specifica, tra cui dispositivi inkjet azionati da piezoelettrici, telecamere ad alta velocità e sistemi di essiccazione sotto vuoto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle soluzioni lipidiche, ai parametri di jetting e alle procedure di allineamento della camera.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di lipidi, proteine transmembrana e agenti di incapsulamento nei vari sistemi modello.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'instabilità del doppio strato lipidico durante l'allestimento e la sensibilità alle vibrazioni ambientali durante il jetting.
