Dimostrazione di Proteolytic attivazione della epiteliale di sodio Channel (ENAC), combinando misure di corrente con rilevamento di Decolleté Frammenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare l'effetto delle proteasi sul canale epiteliale del sodio o ENaC eterologo espresso nei citi di lava zap. Ciò si ottiene misurando prima la corrente di cellule intere sensibile all'amorite in un ovocita. Dopo aver permesso all'ovocita di riprendersi, viene esposto alla proteasi e la corrente viene misurata di nuovo.

Quindi, in parallelo, gli ovociti vengono biotinilati e sottoposti a western blotting per monitorare la comparsa di frammenti di clivaggio gamma ENaC sulla superficie cellulare: si ottengono risultati che mostrano un legame causale tra la scissione del canale e l'attivazione del canale sulla base di una combinazione della tecnica del voltage clamp a due elettrodi e dell'approccio della biotina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la misurazione non pianificata, è che il cita può essere esposto alla proteasi o ad altri agenti farmacologici tra le due misurazioni per un periodo di tempo variabile in un piccolo volume di soluzione di test. Due giorni dopo aver isolato i citi di lava e iniettato con CN secondo il protocollo di testo, utilizzare ND 96 per riempire una siringa di un sistema di perfusione alimentato per gravità e ND 96 contenente ammide per riempire una seconda siringa.

Dopo aver montato le siringhe a 50 centimetri sopra la camera del bagno, accendere una fonte di luce fredda alogena da 150 watt e regolarla a 10 centimetri sopra la camera del bagno del cito, consentendo una buona visualizzazione con il microscopio binoculare, attivare l'aspirazione e posizionare il tubo di aspirazione di fronte all'adattatore del tubo di superfusione nella camera del bagno di ovociti. Successivamente, utilizzando il dispositivo di controllo del flusso per gravità IV, regolare la velocità di superfusione di ciascuna soluzione da tre a cinque millilitri al minuto. Quindi, con un adattatore, collegare le provette per superfusione alla camera del bagno di ovociti utilizzando una micropipetta con capillari in vetro a trazione polare per ottenere diametri della punta inferiori a un micrometro.

Quindi usa tre molari di cloruro di potassio per riempirli per circa un quarto. Inserire i capillari nei portaelettrodi dell'elettrodo di corrente e dell'elettrodo di tensione e con l'uso dei micro manipolatori, inserirli in ND 96 contenente due soluzioni di ammide micromolare. Per misurare le correnti di cella intera sensibili all'ammide, iniziare regolando il pulsante di offset VM per azzerare il potenziale dell'elettrodo di tensione e il pulsante di offset VE per azzerare l'elettrodo di corrente.

Posizionare un sito UO nella camera del bagno e nelle immediate vicinanze dell'elettrodo di rilevamento della tensione. Quindi, utilizzando entrambi i microelettrodi, impalando delicatamente il sito UO, impostare il potenziale di mantenimento dell'amplificatore a 60 millivolt negativi e accendere il registratore grafico. Quindi accendere la soluzione contenente ammide.

Quindi, avviare la registrazione e, se necessario, regolare il guadagno Dopo che la corrente misurata ha raggiunto un plateau stabile, passare alla soluzione priva di ammide. Una volta raggiunto un plateau di corrente, riportare la perfusione alla soluzione contenente ammide. Quindi, dopo che la corrente del sito UO, raggiunge la corrente di base iniziale, spegnere il morsetto di tensione e ritirare delicatamente gli elettrodi per consentire la risigillatura della membrana plasmatica nei siti di impalamento.

Posizionare il sito Uoc in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente da 100 a 150 microlitri di soluzione ND 96 priva di proteasi per cinque minuti prima di trasferire il sito UOC in una soluzione contenente proteasi o in una soluzione di controllo senza proteasi. Per 30 minuti dopo l'incubazione, ripetere la misurazione corrente, scartare gli ovociti difettosi sotto lo stereomicroscopio e preparare l'anti 96 con e senza proteasi appropriata. Preparare le pipette passate etichettandole e fiammeggiare brevemente le punte per evitare lesioni agli ovociti.

Riempire ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con 2,5 millilitri di ND 96 o ND 96 a temperatura ambiente contenente una proteasi. Quindi aggiungere 30 citi per pozzetto e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto 2,5 millilitri di ND 96 ai pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti, trasferire ogni gruppo di ovociti in un pozzetto riempito con ND 96.

Spostare i citi in sequenza in due pozzetti aggiuntivi con ND 96 per lavare via l'eventuale proteasi rimanente e incubarli nel pozzetto finale per cinque minuti, preparare la biotina nel tampone di euforia della biotina secondo il protocollo di testo. Dopo aver inserito ogni gruppo di ovociti in un pozzetto contenente 2,5 millilitri di euforia di biotina, incubare per 15 minuti con leggera agitazione. Quindi, dopo aver posizionato ogni gruppo di ovociti in un pozzetto contenente 2,5 millilitri di tampone di estinzione, per fermare la reazione della biotina, trasferirli in una seconda sosta di tampone di estinzione e incubare per cinque minuti.

Con una leggera agitazione, trasferire ogni gruppo di ovociti in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e utilizzando un millilitro di tampone di lisi, integrato con inibitori della proteasi, lisa i citi facendoli passare attraverso un ago da 27 gauge. Centrifugare i lisati per 10 minuti a 1500 volte G. Trasferire lo Sinatina in una nuova provetta da 1,5 millilitri contenente TRITTON X 100 e MP 40 e incubare le provette su ghiaccio per 20 minuti. Agitando ripetutamente le provette per sciogliere le proteine dopo aver bilanciato 100 microlitri di perle di vagaro per gruppo di ovociti, aggiungerle alle soluzioni detergenti proteiche e incubare i campioni con rotazione dall'alto a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, centrifugare i campioni per tre minuti a 1500 volte G.Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta per rilevare i frammenti di scissione sulla superficie cellulare. Riparare i campioni di gel utilizzando il tampone di lisi per lavare le perle tre volte prima di aggiungere due tamponi campione di pagina XSDS. Dopo aver centrifugato i campioni per tre minuti a 20.000 volte, G, pipetta il surnatante in nuove provette per microfuge.

Analizzare i campioni mediante western blot secondo il protocollo di testo per indagare se la serina, la plasmina proteasi può attivare le correnti mediate da ENaC. Il delta IE dei singoli citi che esprimono ENaC è stato determinato prima e dopo un'incubazione di 30 minuti dei citi in soluzione priva di proteasi o contenente plasmina. Utilizzando la tecnica del morsetto di tensione a due elettrodi, come mostrato qui, l'esposizione alla plasmina ha aumentato il delta IE in ogni cito misurato.

Al contrario, l'incubazione in soluzione priva di proteasi ha avuto un effetto trascurabile. Questa figura confronta l'effetto della chitripsina sull'ENaC wild type e sull'ENaC con i siti di scissione della prostasina e della plasmina mutati. Come si vede qui, il canale mutante ritarda e riduce l'attivazione della corrente mediata da ENaC da parte della chiotripsina.

Inoltre, genera un frammento di scissione a una velocità ridotta rispetto al tipo selvatico ENaC. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come una combinazione dei metodi descritti possa essere utilizzata per correlare l'effetto stimolante delle proteasi sulla presenza interna con la presenza di prodotti di scissione sulla superficie cellulare. Ciò può essere utile per un'ampia gamma di applicazioni, ad esempio per affrontare questioni simili riguardanti la regolazione di altri canali del ferro, trasportatori o recettori transmembrana.