Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi
23 settembre 2014
Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l'annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.
Lo scopo della seguente procedura è quello di costruire microarray di tessuti ottimali o mirati per il successivo utilizzo nella ricerca sui biomarcatori. In primo luogo, viene generato un archivio digitale di vetrini da vetrini di tessuto rappresentativi. Le aree istologiche di interesse sono annotate sui vetrini digitali per specificare le regioni esatte dei corrispondenti blocchi donatori da trasferire al blocco di microraggi tissutali.
Dopo aver creato il design e i layout dei microarray tissutali, i blocchi donatori vengono automaticamente perforati e la causa viene caricata nei microarray tissutali. Utilizzando questo approccio preciso, veloce e automatizzato di nuova generazione, è possibile catturare con precisione aree istologiche precise o anche particolari gruppi di cellule e trasferirli a un microarray di tessuti. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti di micro anello tissutale, come l'utilizzo di un dispositivo fatto in casa o semi-automatico, è chiaramente l'accuratezza istologica.
Ciò si ottiene combinando i punti di forza della patologia digitale con l'esperienza istologica e anche il micro anello tissutale automatizzato che dimostra la procedura oggi sono Kalin Hamman e Jose Galvan. Due assistenza tecnica dal nostro laboratorio utilizzando il software di scansione. Selezionare innanzitutto la modalità automatica per la scansione in campo chiaro.
Quindi fare clic sulle opzioni di scansione per regolare i parametri di qualità della diapositiva. Ora scegli di salvare le scansioni dei vetrini localmente o alla fine del web facendo clic sui parametri del server e imposta la destinazione della scansione al centro del caso. Ora, preparare le diapositive prima di caricare le diapositive nel caricatore Per lo scanner, verificare che le diapositive siano pulite.
Se necessario, pulirli Con l'etanolo, è possibile caricare fino a 25 vetrini in ogni caricatore e lo scanner può essere caricato con un massimo di 10 caricatori. Più caricatori vengono impilati quando vengono caricati. Una volta caricate le diapositive, assegna a tutte le diapositive, i nomi dei file e imposta la cartella di salvataggio nel centro del caso.
Ora inizia a scansionare la diapositiva facendo clic sulla freccia verde. In questa sezione, le posizioni da cui i campioni di tessuto vengono perforati sul vetrino sono impostate mediante annotazioni sul vetrino digitale. Inizia aprendo la cartella delle diapositive digitali.
Nel software di visualizzazione, è possibile apportare modifiche alla cartella stessa. È possibile aggiungere note, riordinare le diapositive e impostare i privilegi dell'utente così come gli allegati. Ora inizia ad annotare le diapositive facendo clic su una.
Apparirà nel visualizzatore. Nel visore. Utilizza lo strumento di ingrandimento per valutare il vetrino e trovare le aree di interesse per l'integrazione nella TMA di nuova generazione.
Utilizzando lo strumento di annotazione TMA, selezionare la dimensione del nucleo desiderato e il colore dell'annotazione. Allega questa annotazione a una diapositiva facendo clic sulla diapositiva. Quindi sposta l'annotazione sulle strutture istologiche desiderate.
Queste annotazioni contrassegnano le posizioni dei punzoni sul blocco di tessuto corrispondente. Ripetere questo processo fino a quando tutte le diapositive non sono annotate. Un'opzione alternativa per la causa dei tessuti è quella di inviarli a una provetta PCR da 0,2 millilitri per l'analisi molecolare.
Annota le diapositive utilizzando un segno di colore diverso per distinguere questi punti da quelli che sono il TMA. Dopo aver effettuato tutte le annotazioni, salva un foglio di calcolo contenente un elenco di tutte le diapositive con le annotazioni corrispondenti e i colori delle annotazioni. Iniziare la microricostruzione tissutale recuperando i blocchi di tessuto di paraffina corrispondenti per tutti i vetrini digitali annotati, d'ora in poi.
Chiamati blocchi donatori. Ordina i blocchi nello stesso ordine delle diapositive digitali. Verificare che ogni blocco abbia uno spessore di almeno quattro millimetri.
In caso contrario, il tessuto dovrà essere reinventato al computer. Apri il microarray di tessuti del software e fornisci un nome per il progetto. Vai al cambio utensile e seleziona il diametro dell'utensile richiesto.
Ora carica fino a 12 blocchi di destinatari nella macchina. Prendi nota dei nomi dei blocchi. Dovrebbero essere tutti etichettati utilizzando lo stesso sistema di numerazione per coerenza.
Quindi, nel software, assegna il nome appropriato a ciascuno dei blocchi per creare un layout TMA. Innanzitutto, crea un nuovo design TMA assegnando il numero di righe, colonne, righe vuote e spaziatura dei punzoni. Salvare il layout e assegnarlo al blocco.
Quindi ripetere il processo per il blocco successivo. Con un nuovo layout o lo stesso layout, le dimensioni dei nuclei possono essere variate tra i blocchi di destinatari. Successivamente, caricare fino a 60 blocchi donatori nella macchina.
Ogni fila contiene fino a 10 blocchi. Da A a F. I blocchi donatori rimanenti verranno caricati successivamente nel software. Assegna a ciascun blocco donatore un nome identificativo.
Un'immagine di ogni blocco verrà acquisita automaticamente. Ora allinea i vetrini digitali con i blocchi donatori corrispondenti. Innanzitutto, seleziona un blocco.
Quindi fare clic sulla diapositiva e confrontare le immagini della diapositiva e del blocco fianco a fianco. Selezionare i punti di riferimento sull'immagine del blocco donatore che corrispondono a punti specifici sul vetrino digitale corrispondente. Quindi fai clic su Avanti e le annotazioni si sposteranno sull'immagine del blocco donatore.
Se le annotazioni sono corrette, fare clic su ciascuna di esse per confermarne la posizione. Quindi fare clic su Start. Questo spinge il microarray a praticare un foro nel punto di riferimento nel blocco ricevente, quindi a praticare un foro dal blocco donatore nella stessa posizione e a trasferire il nucleo al blocco ricevente.
Per raccogliere i nuclei in una provetta PCR, fare clic sullo strumento PCR per il blocco. È possibile utilizzare fino a quattro annotazioni per fornire il tessuto al tubo. Una volta impostati, fai clic su avvia e la donatrice verrà chiamata e la provetta caricata.
Dopo che la macchina perfora e punzona, carotaggi, aggiorna l'immagine del blocco donatore. Procedere con la ripetizione dell'allineamento e dell'annotazione per il blocco successivo. Quindi nuclealo.
Continua a farlo per ogni singolo blocco di donatori. Questo sarà nel TMA. Quando il primo set di 60 blocchi donatori è stato completato, scaricali e caricali in altri 60 blocchi.
Continuare il processo fino a quando tutti i blocchi donatori sono allineati. Dopo aver prelevato circa 500 nuclei, pulire il trapano e lo strumento di punzonatura si sfilerà. Una volta completate le matrici, esportare il progetto.
Un foglio di calcolo con i dati del progetto si troverà nella cartella di esportazione. Mostra la posizione di ciascun campione all'interno di ciascun blocco TMA. Quindi salva le immagini del blocco donatore con annotazioni sovrapposte come file JPEG nella cartella di esportazione.
Questo completa il processo di generazione del blocco TMA. Questo layout TMA mostra sei blocchi NG TMA che sono stati costruiti in due copie per 12 blocchi finali per riempire l'array. Ogni blocco tumorale conteneva 402 macchie di tessuto e ogni blocco di tessuto normale conteneva 268 macchie.
Dopo che 60 blocchi donatori sono stati annotati, la causa è stata perforata. Il tempo di trasferimento del nucleo è stato di circa 12 secondi. La perdita di nucleo è stata minima e il tempo totale per un array, questo progetto è stato complessivamente di circa 24 ore.
Ciò includeva il tempo impiegato per perforare la causa per la successiva analisi molecolare Dopo il processo di N-G-T-M-A. Altri metodi, come l'immunoistochimica nella cito-ibridazione e persino colorazioni speciali, possono essere applicati a questi microarray di tessuti per rispondere ad alcune domande, come ad esempio quali geni o proteine sono espressi o addirittura alterati in diversi tessuti.
Panoramica
Questo protocollo descrive la costruzione e l'ottimizzazione di microarray di tessuti per la ricerca di biomarcatori. Integra la patologia digitale e il posizionamento automatico dei tessuti per migliorare l'accuratezza istologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca sui biomarcatori
- Tecnologia di microarray di tessuti
- Patologia digitale
Sfondo
- Le matrici microtissutali sono essenziali per l'analisi ad alto rendimento dei biomarcatori.
- Gli archivi digitali di vetrini consentono un'annotazione precisa delle aree istologiche.
- I processi automatizzati migliorano l'efficienza e l'accuratezza nel campionamento dei tessuti.
- L'esperienza istologica è fondamentale per una selezione ottimale dei tessuti.
Scopo dello studio
- Costruire microarray di tessuti mirati per la ricerca di biomarcatori.
- Migliorare l'accuratezza del campionamento dei tessuti mediante automazione.
- Ottimizzare il processo di annotazione digitale dei vetrini e di trasferimento del tessuto.
Metodi Utilizzati
- Creazione di archivi digitali di vetrini da vetrini rappresentativi di tessuto.
- Analisi delle aree istologiche di interesse sui vetrini digitali.
- Punzonatura automatizzata dei blocchi donatori per la creazione di microarray di tessuto.
- Utilizzo di software per la progettazione e la gestione del layout dei microarray di tessuto.
Risultati principali
- Costruzione con successo di microarray di tessuti con elevata accuratezza istologica.
- Trasferimento efficiente di campioni di tessuto mirati ai blocchi riceventi.
- Ottimizzazione del flusso di lavoro grazie all'automazione e all'integrazione con la patologia digitale.
- Creazione di un foglio elettronico completo dei dati del progetto per ulteriori analisi.
Conclusioni
- Il protocollo migliora in modo significativo la qualità delle matrici microtissutali.
- La combinazione di patologia digitale con tecniche automatizzate produce risultati precisi.
- Questo approccio presenta vantaggi rispetto ai metodi tradizionali di costruzione delle matrici microtissutali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnologia del microarray tissutale di nuova generazione (ngTMA) risponde all'esigenza fondamentale di un campionamento tissutale preciso e riproducibile nella scoperta e validazione di biomarcatori. Integrando la patologia digitale con il processo automatizzato di allestimento dell'array, il ngTMA migliora l'accuratezza istologica e la capacità produttiva, sostenendo direttamente le fasi di validazione del target e di sviluppo dei saggi. Questo approccio riduce il rumore biologico nei modelli preclinici, aumentando l'affidabilità predittiva nell'identificazione dei composti promettenti e negli studi sui biomarcatori traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche catturando specifiche regioni istologiche, come il centro del tumore, il fronte di invasione e i siti metastatici, per la validazione funzionale del bersaglio.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso l'annotazione precisa delle zone del tessuto, riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi di interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi generando punti di tessuto standardizzati da regioni annotate, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso la perforazione automatizzata e l'abbinamento digitale dei vetrini, garantendo una preparazione campione costante tra diverse esecuzioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Illustra la rilevanza per le malattie e l'allineamento con biomarcatori traslazionali integrando diversi tipi di tessuto/zone istologiche (ad esempio, tessuto tumorale, linfonodo, metastasi epatiche, tessuto normale) provenienti da campioni di pazienti.
- Valore operativo: Descrive la continuità dallo stadio di scoperta fino alla validazione preclinica, producendo copie multiple di ngTMA per analisi parallele mediante immunoeistochemica, ibridazione in situ e colorazioni speciali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
ngTMA si integra nel percorso di scoperta, dalla Fase Iniziale di Scoperta all'Identificazione del Lead e ai lavori Preclinici, fornendo output tissutali quantitativi e con risoluzione spaziale che supportano la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi, la chiarificazione di percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico attraverso l'acquisizione precisa di aree istologiche di interesse mediante annotazione digitale.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o gli output quantitativi, quando supportati dall'articolo, grazie al posizionamento automatizzato di regioni annotate che producono campioni di tessuto standardizzati.
- Analisi: Evidenzia misurazioni, risultati o output statistici che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare diverse condizioni mediante l'annotazione digitale di vetrini ed esportazione dei dati del progetto per ulteriori analisi.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento di biomarcatori solo quando la fonte lo supporta, abilitando l'applicazione di IHC, ISH e colorazioni speciali su ngTMA per valutare l'espressione di proteine/geni attraverso diverse zone del tessuto.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, attraverso la produzione di molteplici copie di ngTMA e l'archiviazione digitale dei vetrini per studi futuri.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in istologia, patologia digitale e progettazione di microarray di tessuti.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi arrayer automatizzato per tessuti, scanner per vetrini e piattaforma web per l'annotazione.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi diversi per i protocolli di annotazione, l'etichettatura dei blocchi e la gestione dei dati.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come tipi di tessuto variabili, dimensioni dei core e volumi di campioni da pazienti.
- Limitazioni pratiche supportate dai materiali di origine, incluse il tempo di annotazione (2-3 min/caso), le esigenze di scansione (3 esecuzioni notturne per 134 pazienti) e il tempo di allestimento dell'array (15-20 ore).
