Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

In questa procedura, gli scaffold PCL elettrofilati vengono impostati in modi diversi per determinare una configurazione ottimale di semina cellulare. In primo luogo, gli scaffold sterili vengono posizionati nelle diverse configurazioni oggetto di indagine, inclusi inserti per colture cellulari, trogoli e recipienti rotanti per bioreattori. Una volta posizionate, un numero noto di cellule viene seminato sull'impalcatura e poi lasciato indisturbato per 20 minuti.

Quindi tutti i campioni vengono accuratamente spostati in un incubatore, posizionati al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius e sottoposti a condizioni statiche o dinamiche prima di ore. Dopo questo periodo di coltura, il numero di cellule che si sono attaccate all'impalcatura viene determinato mediante un saggio del DNA per quantificare la quantità di cellule nel terreno di impalcatura e nelle frazioni dei pozzetti. In definitiva, ciò si ottiene quantificando il DNA presente sullo scaffold, sul pozzetto e nei mezzi circostanti per visualizzare l'attaccamento delle cellule agli scaffold viene utilizzata la microscopia elettronica a scansione o SEM.

Abbiamo avuto l'idea di questa indagine quando sapevamo che i nostri scaffold non coprivano l'intera base della piastra del pozzetto, il che significava che c'era la possibilità che non tutte le celle sarebbero state in contatto con l'impalcatura e quindi in grado di attaccarsi. Per iniziare, impostare gli inserti per colture cellulari sotto il flusso di lamina aprendo gli inserti sterili per colture cellulari a sei pozzetti e separando gli anelli più corti con i denti dai corpi ad anelli più larghi. Quindi prendi l'anello con i denti rivolti verso l'alto e drappeggia una delle impalcature di quattro centimetri al centro dell'anello, assicurandoti che si sovrapponga su entrambi i lati.

Prendi il corpo ad anello e posizionalo sopra l'anello del dente e l'impalcatura. Quindi spingere verso il basso, assicurandosi che l'impalcatura rimanga in posizione e si trovi al centro della coltura cellulare. Inserire. Posizionare l'inserto per colture cellulari con scaffold nel pozzetto di una piastra di legatura a sei pozzetti e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura allo scaffold.

Successivamente, posizionare le vasche di politetrafluoroetilene nelle singole piastre di Petri e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura alla vasca. Usando una pinza, drappeggia una delle impalcature di tre centimetri nella mangiatoia, assicurandoti che la sua lunghezza sia parallela al bordo più lungo della mangiatoia. Per impostare il recipiente del bioreattore sotto il flusso di lamina, erogare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato sterile o PBS attraverso la porta principale del recipiente del bioreattore.

Dopo 10 minuti, rimuovere il PBS e sostituirlo con otto millilitri di terreno di coltura utilizzando una pinza. Inserire una delle impalcature da tre centimetri nell'imbarcazione attraverso la porta principale. Quindi posa fuori dalla porta principale.

Dopo aver eseguito il conteggio delle cellule staminali mesenchimali umane come descritto nel protocollo di testo, aspirare il terreno dalla provetta da centrifuga lasciando il pellet cellulare e sostituirlo con il volume del terreno calcolato. Resus sospendere le cellule e il terreno per una miscelazione uniforme. Utilizzando una pipetta Gilson P 200, erogare lentamente 200 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna impalcatura facendo scorrere la punta della pipetta lungo la lunghezza dell'impalcatura e al di sotto della superficie del liquido del terreno.

Lasciare indisturbato per 20 minuti, altrimenti i recipienti del bioreattore hanno erogato 200 microlitri di sospensione cellulare attraverso la porta principale. Rabboccare i restanti due millilitri di terreno di coltura dalle porte della siringa per ottenere un volume totale di 10 millilitri. Quindi, trasferire i recipienti del bioreattore nel bioreattore a recipiente rotante e impostare la rotazione.

A nove giri/min, trasferire le piastre a pozzetti con gli inserti e le trogoli per colture cellulari sulla piastra di agitazione e impostarle per ruotare a 30 giri/min in un incubatore a 37 gradi Celsius, con anidride carbonica al 5% o nella coltura statica. Trasferire le piastre a pozzetti con gli inserti e le mangiatoie per colture cellulari sullo scaffale di un incubatore per colture cellulari. Impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo quattro ore, rimuovere i campioni dall'incubatore e metterli sotto il flusso di lamina. Quindi, rimuovere le frazioni di terreno da tutti i campioni e metterle in provette da centrifuga etichettate separatamente. Dopo la centrifugazione per cinque minuti a 241 volte G, rimuovere il supinato prima di aggiungere tre millilitri di vortice tampone di lisi, la soluzione per rompere il pellet cellulare che gli scaffold tenevano all'interno degli inserti di coltura cellulare Innanzitutto, liberare lo scaffold tagliando lo scaffold vicino al bordo degli inserti utilizzando uno scaffold.

Quindi, utilizzando una pinza, rimuovere gli scaffold e metterli in provette da centrifuga contenenti tre millilitri di tampone di lisi. Quindi aggiungere tre millilitri di tampone di lisi a ciascun recipiente dell'impalcatura e raschiare la superficie. Rimuovere il tampone di lisi e metterlo in provette da centrifuga etichettate separatamente.

Agitare ogni provetta da centrifuga per circa un minuto per garantire un'agitazione sufficiente e favorire la lisi della membrana cellulare. In una piastra nera a 96 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi per ogni mezzo di impalcatura della frazione del campione e, quindi, al buio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di DNA cellulare a tutti i pozzetti contenenti tampone di lisi e mescolare. Includere delicatamente i pozzetti con tampone di lisi che non contiene DNA e soluzione di DNA cellulare per fornire un controllo negativo e positivo per la piastra a pozzetti.

Utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, misurare l'assorbanza dei pozzetti a 485 nanometri di eccitazione e 520 nanometri di emissione. Confrontare i dati con la curva standard generata dagli standard del DNA secondo le istruzioni del produttore per eseguire la fissazione SEM. Dopo quattro ore di incubazione, rimuovere tutti gli scaffold dai loro recipienti e collocarli all'interno di pozzetti separati di una nuova piastra a sei pozzetti e di un flusso di lamina.

Quindi lavare le impalcature due volte con PBS su ciascuna. Aggiungere bene due millilitri di glutaraldeide all'1,5% in PBS per garantire una copertura completa all'impalcatura. Lasciare la piastra per un minimo di 30 minuti a quattro gradi Celsius per il fissaggio del cel.

Rimuovere la soluzione fissativa e lavare due volte gli scaffold con PBS. Quindi trasferire gli scaffold in una nuova piastra a pozzetti per disidratarli con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua distillata, iniziando con il 50% di etanolo seguito dal 70% e poi dal 90% per ogni concentrazione. Immergere completamente gli scaffold in soluzione e lasciarli agire per tre minuti prima di scartare la soluzione e ripetere.

Una volta disidratati gli scaffold in etanolo al 100% immergendoli completamente in soluzione e lasciandoli agire per cinque minuti, scartare la soluzione e ripetere l'asciugatura chimica degli scaffold. Utilizzo di HMDS all'interno di una cappa aspirante. Immergere le impalcature nell'HMDS e lasciarle agire per cinque minuti prima di rimuovere l'HMDS dopo aver ripetuto una volta.

Rimuovere l'HMDS e lasciare asciugare le impalcature. Quindi montare gli scaffold su tronchetti SEM disponibili in commercio per facilitare la visualizzazione all'interno del rivestimento SEM, i campioni con un rivestimento spotter dorato per due minuti per garantire una copertura sottile e uniforme. Infine, posizionare i campioni all'interno del SEM e visualizzare gli scaffold posizionati nella cella utilizzando un fascio di elettroni a volta di cinque chili.

I risultati evidenziano la posizione delle cellule dopo quattro ore dalla semina per ogni configurazione sperimentale studiata. Questa figura mostra la percentuale di celle che si sono attaccate alla superficie dell'impalcatura durante questo periodo in cui sono state esaminate tutte le configurazioni di semina. La percentuale di attaccamento cellulare è relativamente bassa, ma la massima aderenza cellulare per gli scaffold tenuti all'interno di inserti di coltura cellulare e agitati a 30 giri/min.

L'aderenza più bassa era per gli scaffold tenuti all'interno degli inserti di coltura cellulare e mantenuti in condizioni statiche. Un gran numero di cellule era presente all'interno della frazione del terreno, in particolare per la coltura cellulare. Gli inserti tenuti all'interno di piastre a basso legame al 50% e i recipienti rotanti al 51%Gli scaffold tenuti all'interno dei trogoli hanno dimostrato un numero elevato di celle presenti all'interno del supporto stesso.

48% per l'agitatore e 50% per la scansione statica del trogolo. L'elettromicroscopia ha permesso una valutazione visiva degli scaffold seminati nelle cellule. Le immagini rappresentative hanno evidenziato una presenza limitata di cellule sulla superficie fibrosa, indipendentemente dall'impostazione della semina.

Tuttavia, un numero maggiore di cellule e agglomerati cellulari era presente sugli scaffold tenuti all'interno degli inserti di coltura cellulare e agitati a 30 RP M.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del fatto che la semina di un numero noto di cellule non equivaleva necessariamente a quel numero di cellule che si attaccano effettivamente allo scaffold, specialmente per gli scaffold che non coprono l'intera base delle placche selvatiche. Per scaffold come questi, si raccomanda di ottimizzare prima diverse configurazioni di semina cellulare al fine di massimizzare l'adesione iniziale delle cellule allo scaffold.