Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre grandi quantità di un virus influenzale ad alto titolo, in un sistema economicamente vantaggioso. Ciò si ottiene ottenendo prima uova di gallina appena fecondate prive di agenti patogeni sierici. Nella seconda fase, le uova vengono infettate dal virus dell'influenza attraverso la radice di Alan Toic.

Per 48 ore, il fluido Alan Toic, che contiene il virus, viene quindi raccolto e il virus viene congelato in azoto liquido. Infine, è possibile eseguire saggi di placca ed emoagglutinina per determinare l'influenza del titolo virale dell'Alan Toic raccolto. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di raccolta sono molto delicate e richiedono un'attenta manipolazione degli ovuli e una buona conoscenza della loro anatomia.

Prima di iniziare la procedura si ottengono uova di davian prive di agenti patogeni del siero, appena fecondate da un fornitore adatto. Subito dopo l'arrivo, metti le uova in un'incubatrice umidificata con un girauova automatico per ruotare le uova regolarmente a 37 gradi Celsius e dal 55 al 60% di umidità per 10-11 giorni. Dopo sette-otto giorni di incubazione, indossando guanti disinfettati con etanolo al 70%.

Pulisci un candelabro per uova con l'etanolo e trasferisci le uova dall'incubatrice nei cartoni delle uova vuoti. Quindi spegni le luci e tieni l'estremità grande delle uova, una alla volta contro il candelabro. Se un uovo è fertile, i vasi sanguigni sottili che portano a un embrione a forma di fagiolo dovrebbero essere chiaramente visibili.

Se l'ovulo non è fecondato, si osserverà una piccola macchia di sangue con un tuorlo d'uovo visibile. Quindi scartare le uova non fecondate e rimettere quella vitale nell'incubatrice. Se lo stato di un ovulo non può essere confermato, contrassegnarlo per un'osservazione successiva il giorno 10 o 11 dopo la fecondazione e immediatamente prima dell'uso, diluire una riserva di virus dell'influenza A a una volta 10 al terzo a 10 al quarto PFU per millilitro in PBS sterile integrato con hippie e metterlo sul ghiaccio.

Quindi accendi di nuovo ogni uovo ed elimina gli embrioni morti e immobili. Quindi, togli tre uova dall'incubatrice e disponile in un supporto separato. Con le sacche d'aria sollevate, segna lo spazio aereo delle uova con un pennarello indelebile.

Quindi lavare l'area sopra lo spazio aereo con etanolo al 70% e trasferire lo spazio aereo delle uova in un cartone per uova all'interno di un cappuccio di biosicurezza A BSL two. Ora usa un ago sterile calibro 18 per praticare un piccolo foro nel guscio sopra la sacca d'aria di ogni uovo. Facendo attenzione a non inserire l'ago troppo in profondità per evitare di pugnalare l'embrione o il tuorlo.

Quindi aspirare il virus dell'influenza diluito in una siringa sterile da un millilitro. Attacca un ago calibro 22 e fai avanzare con cautela l'ago con un angolo di 45 gradi nella cavità Alan Toic del primo uovo. Iniettare 0,2 millilitri del virus diluito nell'uovo, quindi dopo aver iniettato gli altri due ovuli, scartare la siringa e sigillare ogni foro con una goccia di colla da una pistola per colla.

Facendo attenzione che la colla non fuoriesca all'interno dell'uovo, quindi rimetti le uova nell'incubatrice. Dopo che tutte le uova sono state inoculate, incubare le uova infette a 37 gradi Celsius e 60% di umidità senza girarle per ottenere il tempo di incubazione ottimale. A seconda del tipo di virus dell'influenza.

Al termine del periodo di incubazione, raffreddare le uova per un minimo di quattro ore a quattro gradi Celsius per uccidere l'embrione e restringere i vasi sanguigni. Quando le uova sono state sufficientemente raffreddate. Trasferirli in una cappa di biosicurezza e in un supporto solido e pulire le superfici delle uova con etanolo al 70%.

Quindi usa delle forbici sterili per aprire il guscio d'uovo sopra la sacca d'aria del primo uovo. Rimuovere il guscio attorno alla sacca d'aria. Facendo attenzione a non danneggiare la membrana chorio Alan Toic.

Quindi utilizzare una pinza smussata sterile per aprire la membrana del chorio Alan Toic e spostare delicatamente l'embrione e il sacco vitellino con una piccola spatola o un cucchiaio, facendo attenzione a non rompere il tuorlo. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, raccogliere con cura il fluido Alan Toic, inclinando l'uovo di lato per raccogliere quanto più liquido possibile quanto necessario. Ogni uovo dovrebbe produrre tra i cinque e i 10 millilitri di liquido leggermente giallastro man mano che ogni uovo viene raccolto.

Raccogli il fluido Alan Toic in tubi conici di plastica da 50 millilitri su ghiaccio. Quando tutto il liquido è stato raccolto, centrifugare il virus e trasferire il fluido trasparente in una nuova provetta da 50 millilitri su ghiaccio. Infine, scartare le uova in un contenitore BSL a due rifiuti e immediatamente Eloqua per chiarificare il fluido toico LAN.

Quindi spezzare, congelare il virus in azoto liquido e mettere i gambi congelati in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Per la conservazione a lungo termine, l'infezione da virus dell'influenza provoca un effetto citopatico che si traduce in zone circolari di cellule allacciate o placche che si formano su un monostrato di cellule. In questo esperimento, le placche sono state visualizzate colorando le cellule con cristallovioletto e 65 placche sono state contate nel pozzetto con una diluizione di 12 volte 10 a 12 negative perché 500 microlitri hanno diluito lo stock virale è stato coltivato sulle cellule.

In questo esperimento, il titolo finale era 1,3 volte 10 per 14° PFU per millilitro. Il test nazionale dell'emoagglutinina è un metodo per la titolazione del virus dell'influenza basato sulla capacità del virus di legarsi alla superficie dei globuli rossi. Come osservato, la sospensione virale agglutina i globuli rossi impedendo ai globuli rossi di depositarsi dalla sospensione.

Un risultato chiaramente negativo è stato osservato con una diluizione del virus da due a meno 10 in 50 microlitri. Pertanto, il titolo finale è 2,1 volte 10 per il quarto HAU per millilitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come propagare il virus dell'influenza inoculando uova di gallina e raccogliendo il fluido atlantico contenente il virus.