Incapsulamento termogenico preadipocytes al trapianto nel tessuto adiposo Depositi tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'incapsulamento di una linea cellulare catabolica termogenica e le sue applicazioni in vitro e potenzialmente in vivo. Per iniziare questa procedura, preparare una sospensione cellulare di alginato di sodio e trasferirla in una siringa da cinque millilitri. Il passo successivo consiste nell'utilizzare un dispositivo di incapsulamento per produrre le microsfere di alginato.

Le microsfere vengono quindi rivestite con una soluzione polionica di poli L lisina e il nucleo di alginato viene successivamente rimosso per formare una membrana semipermeabile attorno a una sospensione cellulare. Il passaggio finale consiste nella co-coltura delle cellule incapsulate con altre linee cellulari o nell'iniezione nei tessuti adiposi dei topi. In definitiva, l'analisi immunologica del sangue mostra una maggiore attività lipolitica negli adipociti co-coltivati con aldeide deidrogenasi, un adipocita carente contenente microcaps.

Mentre l'immunoistochimica mostra il successo del trapianto di cellule incapsulate nei tessuti adiposi dei topi, questo metodo può fornire informazioni sulla termogenesi e sul tessuto apus. Può anche essere applicato ad altri modelli animali esistenti per fornire un sistema di modelli sperimentali a basso costo per testare sottogruppi di cellule in vivo. Per le scoperte biomediche, tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza di secondo livello con flusso laminare.

Per iniziare, rimuovere il vecchio terreno dal pallone di coltura cellulare e sciacquare i preadipociti con 10 millilitri di PBS. Rimuovere il PBS e risospendere le cellule in due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25%. Rimuovere un'aliquota di 10 microlitri dalla sospensione cellulare e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Secondo le istruzioni del produttore, aggiungere DMEM alle celle rimanenti per ottenere la quantità ideale di celle e centrifugare a 480 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver determinato la quantità di cellule necessarie seguendo le indicazioni nel testo del protocollo, sospendiamo il pellet cellulare in un volume appropriato di una soluzione netta di algin sodica al 2%. Trasferire la soluzione di cellule di alginato di sodio in una siringa da cinque millilitri.

Rimuovere eventuali bolle d'aria nella soluzione e capovolgere la siringa per creare una sacca d'aria da un millilitro. Per preparare l'incapsulamento, posizionare un piccolo becher contenente 144 millilitri di una soluzione di cloruro di calcio 100 millimolare. Sotto il beccuccio dell'ago del dispositivo di incapsulamento, collegare l'elettrodo all'incapsulamento con la punta a circa 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio.

Posizionare saldamente la siringa contenente la soluzione cellulare di alginato di sodio nella pompa a siringa. Collegare il tubo di gomma all'apertura della siringa. Spingere lo stantuffo fino a quando la soluzione cellulare di alginato di sodio non entra a metà del tubo.

Regolare la tensione a 5,4 kilovolt e impostare il diametro a 12,06 millimetri sulla pompa a siringa. Regolare la velocità a tre millilitri all'ora. Avviare la pompa, accendere l'incapsulamento e mantenere la tensione a 5,4 kilovolt.

Chiudere la finestra della cappa ed evitare vibrazioni inutili fino al completamento della formazione delle microsfere alginiche. Dopo che tutta la soluzione è passata attraverso l'ago, solidificare le microsfere di alginato a forma di palla nella soluzione di cloruro di calcio per altri 20 minuti prima di rivestirle con polilisina polianionica o PLL. Una volta che le microsfere a forma di sfera di alginato di sodio si sono solidificate, rimuovere il becher contenente le microsfere dal dispositivo di incapsulamento.

Trasferire le microsfere in una provetta da centrifugazione da 50 millilitri. Rimuovere la soluzione di cloruro di calcio dal pellet di microsfere. Lavare le microsfere aggiungendo 30 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e agitando delicatamente il tubo a mano.

Lasciare che le microsfere precipitino per gravità. Quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere la soluzione di cloruro di sodio in questo modo. Lavare le microsfere per un totale di tre volte.

Quindi, aggiungere la soluzione di PLL allo 0,05% alle microsfere. Utilizzare 10 millilitri di soluzione PLL per ogni millilitro di soluzione di alginato di sodio. Vortice a 1000 rotazioni al minuto per 10 minuti, che di solito è sufficiente per il rivestimento PLL.

Dopo aver confermato la formazione del rivestimento PLL, rimuovere la soluzione PLL e lavare le capsule tre volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% come mostrato in precedenza, per rimuovere prima il nucleo alternativo dalle microsfere rivestite di PLL, aggiungere 30 millilitri di una soluzione di citrato di sodio da 50 millimolari al tubo da 50 millilitri. Attendere cinque minuti o fino a quando tutto l'alginato di sodio è sciolto. Lavare le capsule tre volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% come mostrato in precedenza.

Dopo il terzo lavaggio a 20 millilitri di terreno di coltura per il trasferimento in provetta, tutte le capsule contenenti le cellule in un pallone di coltura cellulare gestiscono le cellule incapsulate in condizioni standard di coltura cellulare. Le cellule ospiti per questa procedura devono essere coltivate in piastre a 24 pozzetti fino a quando non sono confluenti. Utilizzare il terreno di coltura dei fibroblasti preparato come descritto nel protocollo allegato.

Testo per la coltura dei preadipociti. Trasferire i microcondensatori nella piastra a 24 pozzetti contenente cellule ospiti confluenti, aggiungere microcondensatori per ottenere un monostrato in ciascun pozzetto, indurre la differenziazione pre-adipocitaria con la differenziazione. Medium incubare per 48 ore.

Dopo 48 ore, modificare il supporto in differenziazione. Medio. Due, sostituire i media con una nuova differenziazione. Medium.Two. Ogni 48 ore le proteine delle cellule saranno analizzate mediante western blot.

Ogni fase della produzione delle microsfere può essere osservata al microscopio. Una microsfera di alginato viene mostrata con un ingrandimento di 20x. Prima del rivestimento di PLL dopo la codifica con PLL e dopo aver sciolto il nucleo di ginnet in uno studio quantitativo, l'espressione della trigliceride lipasi adiposa o A TGL è stata confrontata tra tre adipociti T tre L uno co-coltivati con acellulare wild type o aldeide deidrogenasi uno A un adipocita carente contenente microcaps.

La maggiore espressione di A TGL negli adipociti co-coltivati con un L DH uno A uno deficiente di microcapsule contenenti citi a immersione indica una maggiore attività lipolitica. In uno studio in vivo, le cellule incapsulate marcate con GFP sono state iniettate nel deposito di grasso intraaddominale dei topi. 80 giorni dopo, il cuscinetto adiposo iniettato ha scelto gruppi scoloriti di cellule incapsulate.

Una sezione del deposito di grasso intraaddominale incorporata in paraffina colorata con emato, toina ed eosina mostra gruppi di microcapsule impiantate, cellule incapsulate e adipociti ospiti. La stessa sezione analizzata sotto luce fluorescente mostra le cellule trapiantate marcate con GFP all'interno di capsule rotonde intatte. L'espressione della GFP è anche un indicatore della vitalità cellulare dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica di incapsulamento ha permesso ai ricercatori nel campo delle malattie metaboliche di esplorare possibili trattamenti per l'obesità, la resistenza all'insulina nel diabete di tipo due, l'infiammazione e il cancro e gli organismi modali.