Filtro Analisi aria-campionato per endotossine e contenuto di DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come analizzare accuratamente il contenuto di endotossine e DNA delle particelle sospese nell'aria estratte campionate sui filtri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sull'aerosol biologico indoor e outdoor, come la comprensione delle ragioni di salute. A dimostrare la procedura di campionamento del filtro sarà Yinon Mazar, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per il campionamento ad alto volume, utilizzare filtri in fibra di quarzo. Oppure scegli il tipo specifico di filtro e la dimensione del taglio del filtro, che meglio si adatta alle esigenze di ricerca. Precuocere i filtri destinati al campionamento di composti organici e biologici avvolgendoli prima singolarmente in un foglio di alluminio.

E poi cuocerli in un forno da laboratorio a 450 gradi Celsius per almeno cinque ore. In questo modo si distruggono i residui organici preesistenti. Conservare i filtri cotti a 20 gradi Celsius fino al momento di essere utilizzati per il campionamento.

Quindi, pulire e disinfettare il campionatore ad alto volume come quello descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, posizionare il filtro precotto nella cassetta del filtro ed eseguire il campionatore in conformità con le istruzioni del produttore per raccogliere un campione appropriato. In una cappa di biosicurezza di classe due, tagliare 22 pezzi circolari di materiale filtrante pulito e precotto utilizzando una trivella di sughero pulita di 1,12 centimetri di diametro.

Usa questi pezzi per preparare una gamma di filtri a base di endotossine da utilizzare come controlli. Successivamente, tagliare i filtri contenenti il campione raccolto utilizzando una trivella di sughero pulita di 1,12 centimetri di diametro e posizionare ogni campione nella propria provetta da due millilitri apirogena. Inoltre, trasferire i filtri essiccati con endotossine in provette separate da due millilitri prive di apirogeni.

Aggiungere un millilitro di acqua apirogena in ogni tubo. E agitateli per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando uno shaker da laboratorio. Quindi, centrifugare le provette del campione in una microcentrifuga a 375 volte G per 10 minuti.

Quindi, trasferire il surnatante che contiene le endotossine in un nuovo tubo da due millilitri privo di apirogeni. Preparare una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti apirogeni con coperchio per il test delle endotossine. Stabilendo prima le posizioni dei campioni.

Successivamente, accendi il lettore di micropiastre e programmalo per una reazione cinetica a 37 gradi Celsius con agitazione ogni cinque minuti. Seguono misurazioni a 405 nanometri. Ripetere l'agitazione di cinque minuti e la lettura della piastra 18 volte.

Caricare i campioni nell'acato posizionando 50 microlitri delle soluzioni standard di endotossine precedentemente utilizzate per aggiungere i filtri nelle file da A1 a A10 e da B1 a B10. Posiziona gli spazi vuoti in A11, A12, B11 e B12. Quindi, aggiungere il surnatante dall'estratto del filtro a spillo filato e i suoi spazi vuoti nelle file C e D.Quindi, aggiungere i surnatanti dai campioni sperimentali e dai bianchi nei pozzetti rimanenti, se necessario.

Per attivare il test, aggiungere rapidamente 50 microlitri della soluzione di glicato di amebociti limulus in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente la piastra orizzontalmente. Prima di sollevarlo nel lettore di piastre e iniziare la corsa sperimentale.

Una volta terminato, rimuovere la piastra dal lettore di piastre. Determinare il livello di endotossine in ciascun campione utilizzando la curva standard e calcolare anche l'efficienza con cui le endotossine vengono estratte dai filtri del campione. Innanzitutto, prepara i filtri a base di DNA come descritto nel protocollo di testo allegato.

Per ogni campione filtrante, preparare una miscela di perle di vetro lavate con acido in provette sterili da 0,5 millilitri a 0,1 grammi di perle con un diametro da 425 a 600 micrometri e 0,3 grammi di perle con un diametro inferiore o uguale a 106 micrometri. Successivamente, tagliare tre pezzi circolari da posizioni selezionate casualmente su ciascun campione di filtro utilizzando una piralide di sughero disinfettata di 1,12 centimetri di diametro. Posizionare i campioni filtranti in provette da due millilitri con tappo a vite.

Quindi, aggiungere la miscela di perle di vetro in ciascuna provetta insieme a 60 microlitri del tampone di lisi cellulare fornito con il kit di estrazione del DNA. Chiudere le provette e posizionare i campioni nel battitore di perline. Utilizzare il frusta a microsfere per disgregare meccanicamente le cellule filtrate per un minuto, quindi raffreddare i campioni mettendoli sul ghiaccio per un altro minuto.

Ripeti questo ciclo cinque volte. Procedi a seguire il protocollo del fornitore del kit ed estrai il DNA dalle cellule lisate. Dopo l'eluizione, ricaricare il campione eluito attraverso la colonna di estrazione una seconda volta per migliorare la resa del DNA.

Accendere in anticipo lo strumento di PCR quantitativa per dargli il tempo di riscaldarsi. In un nuovo file di programma, inserire i dettagli per l'esecuzione della PCR quantitativa nel software operativo dello strumento. Quindi, disinfettare la superficie di lavoro con un decontaminante per DNA superficiale e lavorare solo con provette, puntali e reagenti sterili.

Inoltre, posiziona un secchio di ghiaccio accanto al banco di lavoro e posiziona il mix di tac polemoraris nel secchio. Preparare la miscela quantitativa di reazione PCR come descritto nella tabella quattro del protocollo di testo allegato. E conservare la miscela di reazione al buio e sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Quindi, posizionare una micropiastra pulita in un portapiastre per evitare che tocchi la superficie di lavoro e per mantenerla pulita. Aggiungere un microlitro di DNA standard, DNA campione o acqua priva di nucleasi, all'interno dei pozzetti della micropiastra PCR quantitativa in triplicato. Quindi, aggiungi nove microlitri della miscela di reazione master in ogni pozzetto di reazione.

Al termine, coprire la piastra con una pellicola adesiva ottica e sigillarla ermeticamente su tutti i lati. Centrifugare la piastra in una centrifuga dotata di secchi per piastre per un minuto a 1000 volte G.Prima di inserirla nel termociclatore. Infine, attivare ed eseguire il programma di PCR quantitativa preparato.

Durante l'estrazione dell'endotossina, i campioni filtrati vengono centrifugati su una centrifuga per estrarre l'endotossina dal filtro. Le diverse velocità di centrifugazione si traducono in varie efficienze di estrazione. Soprattutto a concentrazioni più elevate di endotossine.

È necessario eseguire un test preliminare per l'efficienza di estrazione per il filtro specifico scelto e il protocollo eseguito. Efficienza di estrazione più elevate si ottengono dai filtri puliti rispetto ai filtri al quarzo campionati ed entrambe queste efficienze sono inferiori a quelle ottenute tramite il rilevamento diretto della soluzione standard. Una volta padroneggiata, l'analisi delle endotossine può essere eseguita in tre ore e mezza se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento del DNA per rispondere a ulteriori domande riguardanti il trasporto di organismi nell'atmosfera. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre in modo efficiente le endotossine e il DNA dai filtri dei campioni d'aria e analizzarli accuratamente.