HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi

L'obiettivo generale di questo metodo è osservare come il trasferimento genico mediato da virus influenzi i fenotipi comportamentali che richiedono l'eterodimerizzazione dei recettori accoppiati a proteine G in modelli murini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuro e della psicofarmacologia. In particolare, come i recettori accoppiati alle proteine g interagiscono tra loro a livello molecolare.

Utilizzando questo metodo possiamo capire come questa interazione influenzi il comportamento in modelli di disturbi psichiatrici, come la schizofrenia e la depressione. Utilizzando questo metodo esamineremo in particolare la serotonina 2a e il recettore metabotropico del glutammato 2, entrambi i quali hanno dimostrato di essere implicati nel meccanismo d'azione dei farmaci usati per trattare i pazienti con schizofrenia. Inizia anestetizzando correttamente il topo secondo i metodi approvati.

Assicurarsi che sia stato ottenuto un piano chirurgico di anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e notando l'assenza di risposta. Quindi applicare il gel oftalmico per proteggere gli occhi. Attacca il mouse alla cornice stereotassica, assicurandoti di regolare l'inclinazione della testa in modo che il cranio sia livellato e piatto.

Applicare lo iodio povidone sul cuoio capelluto esposto. Usando un bisturi, praticare un'incisione sagittale lungo la linea mediana del cranio all'interno dell'area rasata esposta. Quindi attacca i morsetti pureit alla pelle nel sito dell'incisione per assicurarti che il cranio rimanga esposto.

Applicare perossido di idrogeno per sciogliere il periostio ed esporre le suture del cranio. Ora che il bregma e le suture sono visibili, assicurati di regolare il telaio stereotassico per assicurarti che il cranio sia a livello. Allineare le punte dell'ago delle siringhe con bregma e registrare le coordinate di bregma.

Per iniettare bilateralmente la corteccia frontale, aggiungere 1,6 mm alla coordinata bregma caudale rostrale registrata e 2,6 mm alla coordinata bregma laterale mediale registrata. Contrassegnare i siti di iniezione sul cranio e quindi praticare piccoli fori nei siti di iniezione. Con un applicatore con punta di cotone, rimuovere il sangue in eccesso o i frammenti ossei.

Porta l'ago sulla superficie del cervello e abbassalo fino alla profondità della coordinata ventrale dorsale. Quindi iniettare lentamente il contenuto della siringa ruotando lo stantuffo dell'ago per somministrare 0,1 microlitri al minuto per cinque minuti, per un'iniezione di 0,5 microlitri. Lasciare che la siringa rimanga in posizione per cinque minuti.

Trascorso il tempo assegnato, rimuovere l'animale dalla stereotassi, chiudere l'incisione e posizionarlo su un cuscinetto riscaldante. Somministrare l'analgesia post-operatoria secondo il protocollo approvato per gli animali. Eseguire test comportamentali due o tre giorni dopo l'iniezione stereotassica di particelle virali.

Abituare i topi alla stanza per almeno quattro ore prima dell'inizio dell'esperimento. Inizia sciogliendo il DOI in una soluzione salina allo 0,9% a due milligrammi per chilogrammo. Prepara una gabbia domestica senza lettiera e, utilizzando un treppiede, regola una fotocamera in modo che sia direttamente sopra la gabbia domestica.

Calibrare la telecamera in modo che l'intera gabbia domestica si trovi nel campo visivo. Pesare il topo e iniettare per via intraperitoneale la dose appropriata di soluzione fisiologica allo 0,9% o DOI. Rimetti il mouse nella gabbia di casa per dieci minuti.

Dopo dieci minuti, posiziona il mouse al centro della gabbia domestica vuota e assicurati che non ci siano punti ciechi nel campo visivo della telecamera. Premere il tasto di registrazione sulla videocamera e lasciare la stanza. Dopo 30 minuti, interrompere la registrazione e riposizionare il mouse nella gabbia domestica originale.

Ripetere il test comportamentale sul mouse successivo. Chiedi all'arbitro di rivedere i video alla cieca delle condizioni sperimentali. Registra manualmente ogni contrazione della testa durante il video.

Una contrazione della testa è definita come un rapido movimento di scuotimento della testa condotto da un topo. Elaborare i dati come descritto nella parte scritta del protocollo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa dell'espressione del transgene mediata da HSV nella corteccia frontale.

La GFP mGlu2 dell'HSV è stata iniettata nella corteccia frontale e l'espressione della GFP è stata rivelata dall'immunocitochimica. Questa barra di scala rappresenta 200 micron. Questa immagine mostra un western blot dell'espressione del transgene mediata da HSV e della reattività anti-mGlu2 nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2.

Qui abbiamo misurato l'immunoreattività di mGlu2 come monomero. Questo istogramma mostra che l'espressione virale mediata di mGlu2, ma non di mGlu2 chimerica nella corteccia frontale di topi knockout per mGlu2, salva significativamente la risposta di contrazione della testa indotta dall'agonista allucinogeno del recettore della serotonina 2a DOI. I passaggi più critici di questo esperimento sono i tempi tra le iniezioni virali, la risposta alla contrazione della testa e il momento in cui i topi vengono sacrificati.

Qualsiasi ritardo può alterare i risultati dell'esperimento o introdurre ambiguità nei dati. Una volta padroneggiato, l'intervento chirurgico sul topo richiederà circa 30 minuti per iniettare il virus. Anche l'esperimento di contrazione della testa dovrebbe durare circa 35 minuti per topo.

Si consiglia di scaglionare gli interventi chirurgici o di operare su più di un mouse alla volta. In questo modo è possibile mantenere una sequenza temporale che consente di eseguire gli esperimenti di contrazione della testa nei tre o quattro giorni dopo l'intervento chirurgico, che è il momento di massima espressione del costrutto virale. Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.