Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'influenza dei nervi sulla cute normale e patologica. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nella biologia della pelle normale, ad esempio se i nervi cutanei influenzino l'omeostasi e le malattie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di confrontare campioni di cute integra e denervata provenienti dallo stesso animale.

La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché i nervi possono essere difficili da riconoscere ed eliminare con il minimo danno ai tessuti circostanti. In primo luogo, anestetizzare il topo e verificare che abbia raggiunto il corretto livello di sedazione mediante una pinzatura del dito del piede. Inoltre, accertarsi che il topo presenti una respirazione e un battito cardiaco normali.

Ora posizionare l'animale su un tappetino riscaldante in un'area chirurgica asettica. Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere con cura il pelo dalla regione dorsale da cui verrà prelevata la biopsia. Quindi detergere l'area rasata utilizzando salviettine imbevute di Betadine e alcol.

Assicurarsi che tutti i ritagli di capelli siano rimossi dalla sede. Delimitare ora la sede della biopsia utilizzando un pennarello nero. Per ottenere sezioni longitudinali dei follicoli piliferi, il bordo più lungo della biopsia deve essere orientato in direzione anteriore-posteriore parallela alla linea mediana dorsale.

Utilizzando un bisturi, eseguire un'escissione a tutto spessore senza danneggiare la fascia muscolare sottostante. L'emorragia è tipicamente minima. Il campione bioptico deve includere l'epidermide, il derma, il tessuto adiposo sottocutaneo e il pannicolo carnoso.

Appiattire il campione di pelle asportato su un tovagliolo di carta asciutto, con il lato del derma rivolto verso il basso. Rimuovere l'eccesso di tovagliolo di carta e conservare il campione in TBS freddo per un massimo di un'ora, qualora fossero necessari altri prelievi. Tornare al topo e suturare il sito della biopsia utilizzando circa 60 punti di nylon distanziati di circa tre millimetri l'uno dall'altro.

Quindi monitorare il topo in una gabbia di recupero fino a quando non riprende conoscenza. Utilizzare analgesici in conformità con le norme istituzionali designate per la cura degli animali e seguire le loro indicazioni se il topo mostra segni di malessere. Tra sette e dieci giorni dopo l'intervento chirurgico, rimuovere i punti di sutura.

Procedere con l'elaborazione delle biopsie per l'istologia o la colorazione in toto. Anestetizzare l'animale, rasare completamente la cute dorsale e pulire l'area in modo analogo alla procedura di biopsia. Effettuare ora un'incisione utilizzando un bisturi sterile lungo la linea mediana dorsale, dalla base del collo fino a circa mezzo centimetro sopra la coda.

Utilizzando pinze sterili a punta smussata, ritrarre delicatamente la pelle sul lato sinistro allontanandola dalla regione flank per visualizzare il tessuto sottostante dai cuscinetti adiposi scapolari vicino al collo fino appena sopra l'arto posteriore. Identificare ora il nervo cutaneo dorsale al microscopio stereoscopico. Questi appaiono come filamenti bianchi che decorrono in direzione caudale attraverso la fascia traslucida della parete del tronco, per poi compiere brusche curve ed entrare nel tessuto connettivo lasso al di sotto della pelle.

Successivamente, utilizzando pinzette ultrafini, rimuovere il nervo esclusivamente dal lato sinistro dell'animale localizzato nei siti anatomici T3-T12, staccandolo dal punto in cui i suoi segmenti si piegano sulla parete del tronco fino ai punti di entrata nella pelle. Orientare le pinzette verticalmente e afferrare i nervi circa mezzo centimetro al di sotto dei punti di piegatura. Una volta afferrati, tirare verso l'alto in modo da allungare i nervi e separarli dal tessuto circostante per rimuoverli.

Evitare di danneggiare i vasi sanguigni adiacenti. Assicurarsi di mantenere il tessuto umido per tutta la durata della procedura applicando periodicamente gocce di soluzione salina allo 0,9%. Continuare a rimuovere tutti i nervi che si estendono dalla parete del tronco fino alla pelle, ma non alterare i nervi all'interno della fascia densa della parete del tronco.

Successivamente, rimuovere tutti i nervi dal lembo di pelle esposto. Queste fibre costituiscono i rami distali del nervo cutaneo dorsale e appaiono come sottili filamenti bianchi ramificati, localizzati in modo sporadico nel tessuto connettivo sulla faccia dermica del lembo di pelle. Per rimuovere questi sottili rami, posizionare la pinzetta approssimativamente parallela alla superficie dermica, afferrare il nervo e staccarlo con un movimento verso l'alto.

Rimuovere tutti i nervi visibili in questo modo. Non perforare i vasi sanguigni e la pelle. Durante questo passaggio, è importante evitare la rottura dei vasi sanguigni adiacenti.

Se si trova un nervo con un vaso sanguigno adiacente, seguirlo fino a un'area in cui non è presente un vaso adiacente ed eliminarlo strappandolo. Ora, allentare la pelle sul lato destro dell'incisione mediana dorsale, ma non rimuovere alcun nervo. Questo servirà come controllo operatorio contralaterale di finta operazione.

Infine, suturare l'animale e monitorarlo nel periodo postoperatorio come in precedenza. In un secondo momento, per confermare la perdita stabile dei nervi, a settimane di distanza dall'intervento chirurgico, pungere delicatamente l'area denervata utilizzando un ago ipodermico sterile. Osservare se l'animale risponde, tipicamente con un brivido o girando la testa.

Se l'area della pelle è stata stabilmente denervata, l'animale mostrerà una risposta minima o nulla. Prelevare biopsie cutanee dall'area senza risposta e dal lato controlaterale sham per ottenere campioni sperimentali e di controllo abbinati. Dalle biopsie, è importante analizzare più sezioni istologiche al fine di identificare eventuali differenze nell'abbondanza o nella morfologia dei domi tattili tra i campioni sham e quelli denervati.

Il ceppo murino glebe one cree ERT2 consente il targeting della ricombinazione genetica indotta da tamoxifene in aree della pelle che mostrano un'alta attività della via del hedgehog, come le epitelio dei domini tattili. Questi topi sono stati incrociati con topi reporter inducibili abolaxi per visualizzare l'epitelio dei domini tattili. I nodi sono cruciali per il mantenimento sia dei domini tattili normali sia delle cellule di Merkel associate.

Questo è dimostrato sperimentalmente dalla progressiva perdita della morfologia normale della cupola tattile, nonché dalla scomparsa delle cellule depositate di cheratina otto a seguito della denervazione. I nervi sono inoltre fondamentali per promuovere il segnale hedgehog nella cupola tattile, come monitorato dalle espressioni di Glebe one cree ERE2 e dalla colorazione con beta-galattosidasi in preparati di pelle sia finta-operata che denervata. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ablare chirurgicamente i nervi cutanei dorsali per verificare se questi nervi siano coinvolti nella normale funzione della pelle o se modulino patologie.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in modo routinario e affidabile con un minimo di stress per l'animale. Dopo questa procedura, metodi come la colorazione fluorescente degli amminoacidi possono essere utilizzati per verificare se i nervi sono stati completamente ablatti dalla pelle e se l'espressione genica risulta alterata.