Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi
26 settembre 2016
Il protocollo prevede una metodologia per solubilizzare fango granulare aerobico per estrarre polimeri extracellulari alginato-like (ALE).
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di mostrare una metodologia di estrazione per ottenere sostanze polimeriche extracellulari strutturali o EPS, da bioschiume, in particolare da fanghi granulari aerobici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei fanghi granulari. Come la comprensione del processo di granulazione e l'analisi della composizione dell'EPS.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che la presenza di polimeri gelfoaming nell'EPS può essere testata in breve tempo. Centrifugare il fango granulare a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti e decantare il surnatante. Raccogliere i granuli nel pellet per l'estrazione.
Preriscaldare 150 millilitri di acqua di rubinetto in un becher di vetro da 1.000 millilitri su un agitatore magnetico a 80 gradi Celsius. Trasferire tre grammi di granuli in un pallone da 250 millilitri e riempire il pallone fino a 50 millilitri con acqua demineralizzata. Aggiungere 0,67 grammi di carbonato di sodio decaidrato nel pallone per ottenere una concentrazione di carbonato di sodio dello 0,5% in peso per volume.
Mettere il pallone contenente la miscela nel bagnomaria. Coprire separatamente il pallone e il bicchiere con un foglio di alluminio, per evitare l'evaporazione. Mescolare il composto per 35 minuti a 400 giri/min e 80 gradi Celsius.
Trasferire il composto in una provetta da centrifugazione da 50 millilitri. Centrifugare la provetta contenente la miscela a 4.000 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet.
La fase di dialisi è facoltativa per ottenere EPS strutturale da fanghi granulari aerobici. Ma ha diversi vantaggi che sono descritti nel protocollo. Pipettare il surnatante in una sacca per dialisi, con il peso molecolare tagliato di 3.500 dalton, e dializzare per 24 ore contro 1000 ml di acqua ultrapura.
Cambiare l'acqua di dialisi dopo 12 ore per migliorare l'effetto della dialisi. Trasferire l'estratto dializzato in un becher di vetro da 250 ml e mescolare lentamente l'estrazione a 100 giri/min e temperatura ambiente. Monitorare costantemente le variazioni di PH con un elettrodo PH, aggiungendo 1 molare di acido cloridrico a un PH finale di 2,2 05 per ottenere ale in forma acida.
Dopo aver regolato il PH a 2,2, trasferire l'estratto in una provetta da centrifugazione da 50 ml e centrifugare a 4000 volte G e quattro gradi Celsius, per venti minuti. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet gelatinoso. Il pellet gelatinoso è birra in forma acida.
Per ottenere la forma sodica della ale, aggiungere lentamente 0,5 molari di idrossido di sodio al gel, mescolando lentamente il gel con un bastoncino di vetro a mano fino a raggiungere il PH 8,5. Usando una pipetta Pasteur, gocciolare lentamente l'estratto di birra al sodio in una soluzione di cloruro di calcio. Se l'EPS estratto ha proprietà di formazione di gel di idrogel ionico, si formeranno perle sferiche a forma di goccia.
In alternativa, se l'EPS estratto non ha proprietà gelificanti di idrogel ionico, l'estratto si disperderà nella soluzione di cloruro di calcio. Conservare le perle di idrogel e la soluzione di cloruro di calcio per 30 minuti. Usa un cucchiaio per estrarre le perle di idrogel dalla soluzione di cloruro di calcio e trasferirle in una soluzione di EDTA.
Conservare le perle di idrogel in 10 ml di soluzione di EDTA per tre ore a quattro gradi Celsius. Questo test dimostra un esempio dei test di stabilità descritti nel protocollo. Monitorare se c'è una disintegrazione visibile delle perle durante questa conservazione per valutare se le perle possono resistere a queste condizioni.
Se l'estrazione è andata a buon fine, il fango granulare aerobico verrà solubilizzato dopo la fase di estrazione alcalina e si otterrà un pellet dopo aver acidificato e centrifugato l'EPS estratto. Se gli EPS estratti sono EPS strutturali e hanno la capacità di formare idrogel con ioni calcio, si formeranno perle di gel quando si gocciola l'EPS estratto nella soluzione di calcio. Se vengono estratti EPS che non hanno questa capacità di gelificazione, la soluzione di EPS si disperderà nella soluzione di calcio.
Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di eseguire l'estrazione dell'EPS strutturale da fanghi granulari aerobici. Inoltre, dovresti essere in grado di testare la capacità di gelificazione dell'EPS ottenuto con ioni calcio. Abbiamo scelto di mostrare questa metodologia di estrazione per illustrare l'impatto della tecnica di estrazione sull'EPS ottenuto da fanghi granulari aerobici.
Oltre a ciò, volevamo dimostrare che nessuna tecnica di estrazione dell'EPS è universalmente applicabile.
Panoramica
Questo protocollo descrive una metodologia per l'estrazione di polimeri extracellulari simili all'alginato (ALE) dal fango granulare aerobico. Il processo di estrazione è progettato per migliorare la comprensione della composizione e delle proprietà delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS).
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Scienze ambientali
Sfondo
- Le sostanze polimeriche extracellulari (EPS) svolgono un ruolo fondamentale nella formazione e nella stabilità dei biofilm.
- Il fango granulare aerobico è una tecnologia promettente per il trattamento delle acque reflue.
- Comprendere la composizione delle EPS può fornire informazioni sul processo di granulazione.
- La valutazione delle proprietà gelificanti delle EPS può avere implicazioni per diverse applicazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare una metodologia affidabile per l'estrazione dell'EPS dal fango granulare aerobico.
- Analizzare le proprietà strutturali dell'EPS estratto.
- Valutare la capacità di formazione di gel dell'EPS estratto in presenza di ioni calcio.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione del fango granulare per separare il soprannatante e il pellet.
- Estrazione alcalina mediante carbonato di sodio per solubilizzare l’EPS.
- Dialisi per purificare l’EPS estratto.
- Regolazione del pH per ottenere forme di EPS simili all’alginato.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di pellet di consistenza gelatinosa indicanti la presenza di ALE.
- Dimostrazione delle proprietà gelificanti quando l'EPS viene mescolato con cloruro di calcio.
- Valutazione della stabilità dei microgel in diverse condizioni.
- Informazioni sull'impatto della tecnica di estrazione sulle proprietà dell'EPS.
Conclusioni
- La metodologia sviluppata estrae in modo efficace l'EPS dal fango granulare aerobico.
- Comprendere le proprietà dell'EPS può orientare future ricerche nel trattamento delle acque reflue.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare l'applicabilità di questa tecnica di estrazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'estrazione e la caratterizzazione delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS) strutturali dal fango granulare aerobico permette un'analisi precisa dei componenti della matrice del biofilm rilevanti per i processi biotecnologici e la biotecnologia ambientale. La capacità di isolare polimeri simili all'alginato in grado di formare gel (ALE) supporta una riduzione meccanicistica dei rischi nei flussi di lavoro in cui la composizione dell'EPS influisce sulla stabilità del processo e sulle proprietà dei materiali. Questa metodologia fornisce indicazioni per la validazione iniziale degli obiettivi e per la standardizzazione nello sviluppo di saggi successivi nei processi biotecnologici industriali e biotecnologici farmaceutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della composizione dell'EPS per chiarire i percorsi strutturali del biofilm.
- Supporta la validazione funzionale dei polimeri formatori di gel fondamentali per l'integrità del biofilm.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione di protocolli di estrazione per matrici biologiche complesse.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce estratti di EPS standardizzati per saggi riproducibili successivi.
- Permette la valutazione quantitativa della capacità di formazione di gel mediante la formazione di perle indotta da calcio.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma definendo i parametri di estrazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea gli output dell'estrazione a modelli di biofilm pertinenti alla malattia o al processo, quando applicabile.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo una caratterizzazione consistente dell'EPS.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica negli interventi mirati ai biofilm.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrazione colloca l'isolamento degli EPS all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di saggi, sostenendo flussi di lavoro dalla verifica delle ipotesi alla validazione di modelli preclinici.
- Biologia della scoperta: chiarisce il ruolo dell'EPS strutturale nella formazione e stabilità del biofilm.
- Screening: fornisce letture quantitative riproducibili di formazione del gel per analisi comparative.
- Analisi: offre risultati misurabili come la stabilità delle perle e le soglie di solubilizzazione.
- Ricerca traslazionale: consente di allineare l'estrazione dell'EPS con modelli pertinenti di biofilm o materiali.
- Riutilizzo aziendale: stabilisce una capacità standardizzata di estrazione per diverse applicazioni di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità negli studi sui biofilm relativi alla EPS.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra i flussi di lavoro di estrazione e saggio.
- Valore strategico: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di processi mirati ai biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio di iniziative di ricerca e sviluppo focalizzate su biofilm ed EPS.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in biologia dei biofilm e tecniche di estrazione di polimeri.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per centrifugazione, controllo del pH e dialisi.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di estrazione e di test di stabilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi sistemi di fango o biofilm in base alla composizione della matrice.
- L'efficacia dell'estrazione e la valutazione della formazione di gel dipendono dal metodo e non sono universalmente trasferibili.
