Viabilità imaging cellulare su scaffold non trasparenti - con l'esempio di un romanzo a maglia Titanium Implant
7 settembre 2016
Qui presentiamo una tecnica di imaging fluoroforo base per rilevare la vitalità cellulare su uno scaffold di titanio non trasparente nonché per rilevare intravedere le impurità dell'impalcatura. Questo protocollo risolve i l'inconveniente di immaginare interazioni cellula-cellula o cellula-metallo su impalcature non trasparenti.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di visualizzare la microstruttura e l'adesione cellulare su un impianto di nucleo in titanio lavorato a maglia non trasparente, utilizzando tecniche di imaging fluorescente. Questo metodo fa progredire l'analisi dell'ingegneria tissutale con scaffold non trasparenti. Un vantaggio di questa tecnica è che si può tracciare la vitalità cellulare e la proliferazione sullo scaffold con una coltura definita a pedale.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la colorazione fluorescente e, successivamente, la visualizzazione sono impegnative. Le proprietà individuali dell'impalcatura, come la dimensione dei pori, possono influenzare la tempistica e/o la fluorescenza dell'impalcatura può influenzare la scelta dei fluorofori che si stanno utilizzando. Metti fino a cinque impalcature spesse sei o sette millimetri in un tubo da 50 millilitri e lavale con acqua tre volte per 20 minuti per lavaggio.
Fallo a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Successivamente, lavare gli scaffold in 30 millilitri di soluzione Triton X-100 all'1% nelle stesse condizioni. Quindi, eseguire altri due lavaggi con acqua.
Ora, sonicare in sequenza gli scaffold in reagenti di grado 99% acetone, 99% isopropanolo ed etanolo 99%. Eseguire ogni fase di sonicazione due volte per cinque minuti per sonicazione. Quindi, sonicare l'impalcatura altre tre volte in acqua per un totale di 15 minuti.
Termina posizionando gli scaffold su un fazzoletto privo di lanugine e asciugandoli all'aria per una notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, autoclavare gli scaffold per 15 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI. Per confermare che la pulizia ha funzionato, utilizzare la fluorescenza indiretta.
Caricare un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 2000 microlitri della soluzione colorante zolfo-rodamina B appena preparata e, utilizzando una pinza, trasferire un'impalcatura in quel pozzetto. Quindi, acquisisci immagini negative dell'impalcatura utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri a cubo LED RFP e cerca le impurità ad alto ingrandimento. Utilizzando la cabina di biosicurezza, trasferire gli scaffold puliti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
Aggiungi 500 microlitri di terreno di coltura a 37 gradi Celsius a ciascun pozzetto e lascia in ammollo l'impalcatura per 15 minuti. Nel frattempo, preparare 500.000 cellule SEP1 infette da Ad-GFP per 1 millilitro di terreno. Dopo 15 minuti, aspirare completamente il terreno dagli scaffold e posizionarli con 100 microlitri di sospensione cellulare.
Quindi, incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la breve incubazione, aggiungere altri 500 microlitri di terreno di coltura e incubare gli scaffold per 24 ore. Il giorno successivo, cambiare il terreno di coltura per rimuovere le cellule non aderenti.
Quindi, valutare l'aderenza e la diffusione delle cellule sugli scaffold, utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un set di filtri a cubo LED GFP. Per una colorazione vivo-morto, prima piastrate le cellule SEP1 sull'impalcatura come prima. Dopo 24-48 ore, aspirare completamente il terreno di coltura e lavare gli scaffold con DPBS per cinque minuti a temperatura ambiente.
Ora, colorare le cellule utilizzando un terreno di coltura contenente Calceina AM, Hoechst 33342 e omodimero di etidio. Questi tre fluorofori sono tutti sensibili alla luce, quindi è fondamentale mantenere le cellule al buio in avanti. Incubare le cellule per 30 minuti con i fluorofori per ottenere una distribuzione uniforme in tutta l'impalcatura.
Le caratteristiche specifiche dell'impalcatura influenzeranno questo tempo di incubazione. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con DPBS utilizzando un millilitro per pozzetto. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente.
Subito dopo i lavaggi, documentare gli scaffold utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per misurare la vitalità cellulare nel tempo, utilizzare le misure di conversione della resazurina. Innanzitutto, aspirare completamente il terreno di coltura dalle cellule SEP1 posizionate in una piastra da 24 pozzetti e lavare le cellule con 500 microlitri di DPBS per pozzetto.
Quindi, coprire le cellule con il volume richiesto di soluzione di lavoro sterile di resazurina e includere un pozzetto con solo resazurina. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire 100 microlitri di surnatante condizionato da ciascun pozzetto in una piastra da 96 micropozzetti per misurarne la fluorescenza come descritto nel protocollo di testo.
Per un'ulteriore coltivazione, rimuovere la resazurina dal pozzo e lavare tre volte con un millilitro di DPBS. Eseguire ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto di cellule e continuare la loro incubazione per ulteriori misurazioni nel tempo.
Utilizzando la colorazione fluorescente indiretta, sono state documentate le impurità pre-pulizia per ottimizzare il protocollo di pulizia. Una significativa riduzione del carico di sostanze sull'impalcatura mostra l'efficienza del protocollo di pulizia descritto. Gli impianti successivi utilizzati per il trattamento dell'artroplastica sono determinati dagli eventi che si verificano all'interfaccia del materiale cellulare.
Dopo 24 ore di aderenza con gli scaffold, le cellule SEP1 si erano attaccate. I fluorofori sono stati quindi applicati per esaminare la morte cellulare e la proliferazione per un periodo di tempo sugli scaffold. La colorazione vivo-morto ha mostrato una colorazione nucleare blu con fluorescenza rossa nelle cellule morte e fluorescenza verde nelle cellule vitali.
Inoltre, la vitalità cellulare sullo scaffold è stata quantificata utilizzando il saggio di conversione della resazurina. Nell'arco di due settimane, sono stati raccolti dati su cellule coltivate con o senza scaffold. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di regolare i fluorofori che si stanno utilizzando in base all'impalcatura e al microscopio che si hanno a disposizione.
Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi, come la colorazione immunofluorescente, per visualizzare la presenza di proteine o l'attivazione di cascate di segnalazione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'artroplastica perché l'interazione della faccia cellulare con il tessuto circostante in vivo ne definirà la funzione e la durata.
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Panoramica
Questo studio presenta una tecnica di imaging fluorescente per visualizzare l'adesione cellulare e la vitalità su un'impalcatura di titanio non trasparente. Il metodo affronta le sfide legate all'imaging delle interazioni cellulari con materiali non trasparenti, migliorando l'analisi nell'ingegneria tissutale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ingegneria dei tessuti
Sfondo
- Le impalcature non trasparenti pongono sfide per l'acquisizione di immagini delle interazioni cellulari.
- L'acquisizione di immagini fluorescenti può fornire informazioni sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare.
- Le proprietà dell'impalcatura, come la dimensione dei pori, possono influenzare i risultati dell'acquisizione di immagini.
- Una dimostrazione visiva è essenziale a causa della complessità della colorazione fluorescente.
Scopo dello studio
- Visualizzare la microstruttura e l'adesione cellulare sugli impianti in titanio.
- Migliorare i metodi di analisi per scaffold non trasparenti.
- Risolvere i problemi di imaging associati a questi materiali.
Metodi Utilizzati
- Tecniche di imaging fluorescente per la valutazione della vitalità cellulare.
- Preparazione di scaffold in titanio per l'imaging.
- Protocolli di lavaggio per garantire chiarezza nei risultati dell'imaging.
- Valutazione delle proprietà dello scaffold che influenzano la scelta del fluorocromo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dell'adesione cellulare su scaffold in titanio.
- Dimostrata capacità di tracciare la vitalità e la proliferazione cellulare.
- Individuato l'impatto delle proprietà dello scaffold sull'imaging.
- Fornito un protocollo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- La tecnica migliora la comprensione delle interazioni tra cellule e materiali.
- Offre una soluzione alle difficoltà di imaging associate a scaffold non trasparenti.
- Applicazioni future potrebbero migliorare i risultati nell'ingegneria tissutale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione dell'viabilità cellulare su scaffold non trasparenti, come impianti in titanio tricotati, affronta un collo di bottiglia critico nella ricerca e sviluppo di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa. Questa capacità consente una valutazione diretta delle interazioni tra cellule e materiale, supportando la previsione dell'idoneità biologica dello scaffold e della sua integrazione funzionale. Il metodo è strategicamente posizionato per guidare la fase iniziale della scoperta, la validazione degli obiettivi e l'avanzamento mirato alla riduzione dei rischi di nuovi materiali impiantabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la visualizzazione diretta dell'adesione cellulare e della vitalità su biomateriali opachi, chiarificando i meccanismi all'interfaccia cellula-materiale.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio quantificando la proliferazione e la sopravvivenza cellulare su impalcature candidate.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico di nuovi materiali per impianti prima di studi in vivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un protocollo standardizzato per la preparazione e l'analisi di scaffold non trasparenti in vitro.
- Fornisce risultati quantitativi riproducibili sulla vitalità e proliferazione cellulare mediante saggi basati sulla fluorescenza.
- Consente un confronto affidabile tra protocolli di pulizia degli scaffold e modifiche della superficie ai fini dello screening successivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di biocompatibilità in vitro ai requisiti translazionali per dispositivi impiantabili.
- Supporta la continuità dalla valutazione dello scaffold nella fase di scoperta alla selezione dei modelli preclinici.
- Riduce il rischio biologico consentendo un rilevamento precoce di interazioni avverse tra cellule e materiale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica per i biomateriali impiantabili, collegando la verifica delle ipotesi iniziali alla validazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'adesione, la vitalità e la proliferazione cellulare su impalcature candidate per guidare la selezione dei materiali.
- Screening: Standardizza i saggi di vitalità e proliferazione per materiali non trasparenti, favorendo riproducibilità e scalabilità.
- Analisi: Fornisce letture quantitative basate sulla fluorescenza per confronti tra diverse condizioni e nel corso del tempo.
- Ricerca traslazionale: Allinea i dati in vitro sulle interazioni cellula-materiale con i requisiti preclinici per gli impianti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la valutazione di svariate piattaforme di impalcature non trasparenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella biocompatibilità e nell'integrazione funzionale dello scaffold.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati e riproducibili per l'imaging e la quantificazione di materiali opachi.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione per nuovi candidati impiantabili, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli scaffold tecnologici da avanzare, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e tecniche di coltura cellulare.
- Necessita l'accesso a fluorofori appropriati e a strumentazione per imaging compatibile con le proprietà del supporto.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo le procedure di pulizia e colorazione, al fine di garantire riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse geometrie del supporto, dimensioni dei pori o composizioni del materiale.
- La scelta del fluoroforo e dei parametri di imaging devono essere ottimizzati per ogni tipo di supporto al fine di evitare interferenze nel segnale.
