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L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le conseguenze sull'integrità e sulla permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con linfociti T attivati. Questo metodo contribuisce a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroimmunologia, ad esempio in che modo l'interazione diretta tra linfociti T e cellule endoteliali influisce sull'integrità e sulla permeabilità della barriera ematoencefalica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione automatizzata e in tempo reale della funzione della barriera a seguito della modulazione mirata dell'interazione tra linfociti T e cellule endoteliali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale, poiché forniscono informazioni sul deterioramento della barriera ematoencefalica mediato dai linfociti T, un passaggio cruciale nella patogenesi di tali malattie. Questo metodo si concentra sulle proprietà della barriera ematoencefalica marina durante l'EAE. Tuttavia, può essere applicato anche a modelli di barriera ematoencefalica murina o umana, nonché a studi su altri disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa di possibili problemi legati al momento ottimale per la coltura combinata di cellule endoteliali primarie e l'attivazione dei linfociti T. Abbiamo sviluppato inizialmente questo metodo quando abbiamo intrapreso lo studio degli effetti di diversi livelli di attivazione dei linfociti T sulle proprietà della barriera ematoencefalica durante l'EAE, un modello animale della sclerosi multipla. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'allestimento di colture cellulari co-abbinate di linfociti T e cellule endoteliali è difficile da apprendere, in quanto variazioni iniziali dei linfociti T tra pozzetti potrebbero portare successivamente a rappresentazioni errate dei risultati.

Per iniziare questa procedura, al quinto giorno dopo l'isolamento delle MBMEC, rivestire preventivamente le inserti permeabili con 80 microlitri di soluzione di rivestimento per MBMEC per ogni inserto. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore. Dopo aver rimosso la soluzione di rivestimento per MBMEC dagli inserti, lavare le MBMEC aggiungendo due millilitri di PBS a temperatura ambiente in ogni pozzetto, aspirandola dopo un minuto, quindi ripetere questa procedura un'altra volta.

Successivamente, aggiungere 0,05% di tripsina-EDTA in quantità di 300 microlitri per pozzetto e incubare per cinque-dieci minuti. In seguito, aggiungere due millilitri di mezzo MBMEC in ogni pozzetto per arrestare la tripsinizzazione. Quindi, trasferire le cellule raccolte in un tubo da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare il campione a 700 × g per otto minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo otto minuti, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo MBMEC senza puromicina. Per contare le cellule, mescolare 90 microlitri di blu di tripano 0,04% con 10 microlitri di sospensione cellulare; pipettare quindi 10 microlitri della miscela tra il vetrino coprioggetto e l'emocitometro.

Successivamente, seminare due volte 10 alla quarta cellule per inserto. Aggiungere 810 microlitri di mezzo MBMEC nel compartimento inferiore di ogni pozzetto e posizionare la piastra con gli inserti nell'incubatrice fino al momento della misurazione del TEER. Per stimolare le cellule T positive per CD4, rivestire in anticipo una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo con anticorpo anti-topo CD3 purificato a una concentrazione finale desiderata per tre ore a 37 gradi Celsius.

Dopo aver isolato i linfociti T, lavare la piastra pre-ricoperta due volte con PBS. Successivamente, aggiungere l'anticorpo anti-CD28 purificato ai linfociti T isolati a una concentrazione finale desiderata e mescolare accuratamente. Quindi, coltivare i linfociti T e lasciarli a 37 gradi Celsius per due o tre giorni.

Per impostare la misurazione del TEER, posizionare il modulo a 24 pozzetti dello strumento TEER all'interno della cappa a flusso laminare. Rimuovere i coperchi e inserire i supporti con MBMEC nello strumento, utilizzando pinze. Successivamente, pipettare 810 microlitri di mezzo fresco nel compartimento inferiore dei pozzetti del modulo, aggiungendoli con attenzione tra il supporto e la parete del pozzetto del modulo.

Successivamente, chiudere i coperchi e posizionare lo strumento nell'incubatrice. Collegare lo strumento al computer. Quindi, accendere il controllore dello strumento e aprire il software.

Nella finestra a comparsa, selezionare "Nuova misurazione", spuntare le caselle "Mostra TER" e "Mostra Ccl", quindi premere Avvia. Al termine della prima misurazione, selezionare "Seleziona tutte le pozzette" nella scheda Risultati per visualizzare tutti i valori di TEER e Ccl.

Quindi, salvare il file. Successivamente, scegliere il punto temporale per effettuare la co-coltura di MBMEC con linfociti T in cui il Ccl è stabile e inferiore a un microfarad per centimetro quadrato e il TEER ha raggiunto il suo livello massimo. Esaminare attentamente i valori assoluti di TEER e Ccl ed escludere le pozzette in cui le MBMEC non hanno sviluppato monociti sufficientemente confluenti deselezionando tali pozzette.

Raggruppare le restanti pozzette facendo clic con il tasto destro sulle pozzette e selezionando "aggiungi pozzetta a nuova pozzetta media". Assegnare un nome nella finestra a comparsa e ripetere l'operazione per tutte le singole pozzette da raggruppare. Quindi verificare tutte le pozzette medie per confermare che ciascuna abbia le stesse condizioni iniziali prima della coltura in co-coltura. Nella scheda dell'esperimento, premere pausa.

Scollegare lo strumento ed estrarlo dall'incubatore. Successivamente, rimuovere i coperchi all'interno della cappa a flusso laminare. In seguito, rimuovere parte del mezzo dall'inserzione nel compartimento della pozzetta superiore.

Aggiungere linfociti T alle MBMEC pipettando attentamente 150 microlitri di mezzo. Successivamente, ricollegare lo strumento e premere riprendi misurazione. Dopo 24 ore, premere interrompi nella scheda dell'esperimento e salvare il file.

Qui sono mostrate la morfologia a fuso e la colorazione immunofluorescente di PECAM-1 e Cldn-5 a cinque giorni dall'isolamento delle MBMEC. Qui di seguito sono riportati i valori di TEER e Ccl prima e dopo il raggruppamento dei singoli pozzetti prima dell'aggiunta delle cellule T. La curva blu non viene utilizzata per l'esperimento poiché le MBMEC in questo pozzetto non hanno sviluppato un TEER elevato come negli altri pozzetti.

In questo esperimento, da 35 a 55 linfociti T specifici positivi per CD4 sono stati stimolati in modo specifico per l'antigene per cinque giorni. I linfociti T naïve e le citochine proinfiammatorie, interferone gamma e TNF-alfa, sono stati utilizzati come controllo negativo e positivo, rispettivamente. In questo caso, i linfociti T sono stati stimolati con la stessa quantità di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e quelli coltivati per tre giorni hanno mostrato una maggiore propensione a causare la rottura della barriera rispetto ai linfociti T coltivati solo per due giorni.

I risultati mostrano che le cellule T stimolate, ma non i loro supernatanti, causano un danno sostanziale alle MBMEC, indicando che il contatto diretto tra le cellule T e le MBMEC è fondamentale per la rottura della barriera. D'altro canto, l'aggiunta dell'inibitore della granzima B due alla coltura delle cellule T ripristina in misura maggiore l'integrità delle MBMEC, evidenziando il ruolo cruciale di questa molecola citolitica nel provocare il danno alle MBMEC e il conseguente calo del TEER. Una volta padroneggiato, questo esperimento può essere completato in 12 giorni se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di scegliere il punto temporale corretto per impostare la co-coltura di cellule T e cellule endoteliali.

Una volta seguita questa procedura, possono essere utilizzati altri saggi, come la microscopia a immunofluorescenza, la citometria a flusso e i saggi probabilistici. Per affrontare ulteriori domande, come: In che modo questa interazione influisce sull'espressione delle molecole delle giunzioni strette, sulla permeabilità e sul grado di trasmigrazione dei linfociti T? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neuroimmunologia per esplorare i disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale nei topi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara di come valutare gli effetti diretti tra linfociti T attivati e cellule endoteliali in relazione all'integrità e alla permeabilità della barriera ematoencefalica.