Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione
5 febbraio 2017
Questo protocollo descrive il funzionamento di un portacampioni flusso di liquido per la scansione di trasmissione microscopia elettronica di AuNPs in acqua, usati per l'osservazione dei processi dinamici nanoscala.
L'obiettivo generale della microscopia elettronica a trasmissione a scansione di fase liquida è quello di osservare strutture e fenomeni di nanomateriali in campioni biologici completamente incorporati in uno strato liquido di spessore fino a diversi micrometri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scienza dei materiali, come il comportamento dei nanomateriali nei liquidi e lo studio di campioni biologici nell'ambiente liquido naturale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni morfologiche su scala nanometrica sui campioni in liquido.
In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il caricamento del supporto del campione e l'acquisizione delle immagini non sono così semplici come quelli fatti per la prima volta con la microscopia elettronica. Per iniziare la procedura, in una cappa a flusso laminare pulita, pulire un vetrino per microscopia ottica con un fazzoletto privo di fibre ed etanolo puro. Posizionare il vetrino su un fazzoletto per camera bianca in una capsula di Petri con coperchio.
Per manipolare i microchip SiN, utilizzando una pinzetta rivestita di carbonio, afferrare il microchip con decisione ma con attenzione sui lati lunghi, mantenendo sempre la membrana SiN rivolta verso l'alto. Usando questa tecnica, posiziona cinque microchip senza distanziatore e cinque microchip con un distanziatore a 200 nanometri sul vetrino. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in una cappa aspirante.
Posizionare i microchip in un becher di acetone di grado HPLC con la membrana rivolta verso l'alto. Agitare delicatamente il becher per due minuti per rimuovere il rivestimento protettivo, facendo attenzione a non capovolgere i microchip. Quindi, trasferisci rapidamente i microchip in un becher di etanolo puro.
Coprire il bicchiere con un foglio di alluminio. Far roteare delicatamente il becher per due minuti per completare la rimozione del rivestimento e portarlo in una capsula di Petri chiusa alla cappa a flusso laminare. Posiziona i microchip su un fazzoletto fresco per camera bianca, facendo attenzione a non capovolgere i microchip mentre vengono rilasciati dalle pinzette.
Lasciare asciugare i microchip per qualche minuto. E poi posizionare i microchip sul vetrino nella capsula di Petri. Chiudere la capsula di Petri e portare i microchip in un pulitore al plasma.
Posizionare il vetrino e i microchip nel pulitore al plasma ed eseguire un programma di pulizia di cinque minuti per rimuovere gli idrocarburi dalla membrana SiN. Utilizzando un microscopio ottico, ispezionare i microchip per verificare la presenza di membrane rotte o particelle di sporco. Scartare i microchip danneggiati o sporchi.
Nella cappa a flusso laminare, immobilizzare i microchip in una scatola di trasporto pulita con una superficie interna appiccicosa. Applicare una goccia da un microlitro di una soluzione di nanoparticelle acquose d'oro stabilizzata con citrato a tre molari sulla membrana SiN di ciascun microchip senza distanziatore e lasciare asciugare la soluzione. Quindi, applicare un microlitro di acqua deionizzata sulla membrana per lavare via sale e tensioattivi.
Dopo 30 secondi, utilizzare la carta da filtro per tamponare accuratamente l'acqua e lasciare asciugare i microchip. Posizionare la punta del supporto TEM per il flusso di liquido sotto un microscopio ottico binoculare. Rimuovere il coperchio in titanio dalla punta del supporto e posizionarlo su un foglio di carta stagnola.
Installare una pompa a siringa microfluidica con una siringa di vetro da un millilitro contenente 0,5 millilitri di acqua di grado HPLC. Collegare la siringa al sistema di flusso e avviare la pompa. Quando l'acqua viene scaricata attraverso il sistema, controllare le linee per perdite o restringimenti di flusso.
Al termine del pompaggio, rimuovere il risciacquo dallo scomparto della cella del liquido e asciugare la punta del supporto con carta da filtro. Ispezionare la punta del supporto con il microscopio ottico. Asciugare la punta con un panno per camera bianca e rimuovere la polvere o le fibre con una pinzetta rivestita di PTFE pulita.
Ispezionare il coperchio della punta del supporto, l'O-ring e le viti e rimuovere polvere o fibre con una pinzetta rivestita in PTFE. Posizionare l'O-ring nei gruppi di supporto. Posiziona la prima vite e ruotala un paio di volte in modo che rimanga.
Con una pinzetta curva pulita, posizionare il microchip del campione nella tasca della punta di supporto con la membrana SiN rivolta verso l'alto. Utilizzare il microscopio ottico binoculare per verificare che il microchip sia posizionato correttamente. Versare una goccia da 0,3 microlitri di acqua filtrata pura sul microchip del campione.
Tenere il microchip in posizione con una pinzetta. Quindi, prendi un microchip distanziatore con una pinzetta curva tenuta capovolta. Ruotare con cautela le pinzette in modo che la membrana del microchip sia rivolta verso il basso.
Posizionare il microchip distanziatore sul microchip del campione. Posizionare il materiale riflettente sotto la punta del supporto e controllare l'allineamento del microchip sotto il microscopio ottico binoculare. Usa una pinzetta per regolare con cura i microchip se le finestre SiN non sono allineate.
Quindi, sollevare il coperchio della camera dei campioni con una pinzetta. Capovolgere il coperchio e, senza toccare i microchip, appoggiare il lato posteriore del coperchio sulla punta del supporto. Posizionare la vite rimanente utilizzando una pinzetta e serrare entrambe le viti in modo iterativo.
Serrare con cura fino a quando non incontrano resistenza. Le finestre possono rompersi facilmente se il serraggio è troppo forte. Avviare un flusso di liquido di quattro microlitri al minuto attraverso il sistema e verificare la presenza di perdite nella punta del supporto.
Quindi, portare il supporto in una stazione di pompaggio del vuoto ed eseguire un controllo delle perdite. Assicurarsi che la pressione raggiunga almeno 10 al quinto mbar negativo entro cinque minuti. Posizionare il supporto nel suo involucro.
E portare il supporto al microscopio elettronico. Impostare il microscopio in modalità STEM. Misurare la densità di corrente del fascio di elettroni con un sottile film di carbonio rivestito con nanoparticelle d'oro come campione di riferimento senza acqua.
Avviare il flusso di acqua pura a una velocità non superiore a due microlitri al minuto. Inserire il supporto TEM del flusso di liquido nel blocco del carico a vuoto e iniziare l'evacuazione. Assicurarsi che la pressione diminuisca normalmente.
Quindi inserire completamente il supporto TEM nel microscopio. Una volta che la pressione è sufficientemente bassa, aprire la valvola a fascio e inserire il rilevatore ADF. Impostare il microscopio in modalità di acquisizione continua e traslare il tavolino del campione nelle direzioni X e Y per trovare la finestra SiN.
Regola il contrasto e la luminosità in modo che i bordi della finestra siano chiaramente visibili. Traslare lo stage nelle direzioni X e Y in modo che un angolo della finestra si trovi al centro del campo visivo. Quindi reimpostare la lente dell'obiettivo.
Regolare la posizione verticale del tavolino per campioni per mettere a fuoco grossolanamente l'angolo. Inclinare il tavolino di cinque gradi avanti e indietro per verificare che il campione sia all'altezza eucentrica. Centrare l'angolo della finestra nel campo visivo e quindi memorizzare la posizione del tavolino nel software.
Traslare lo stadio nelle direzioni X e Y fino a quando le nanoparticelle d'oro sono visibili. E poi mettere a fuoco l'obiettivo. Annotare la densità di corrente e calcolare lo spessore della cella liquida.
Traslare il palco nelle direzioni X e Y per individuare un'area con almeno 20 nanoparticelle d'oro. Imposta i parametri e acquisisci un'immagine. Nanoparticelle d'oro vengono immobilizzate su una membrana di nitruro di silicio e sottoposte a imaging con STEM in fase liquida.
In acqua pura, le nanoparticelle d'oro hanno mantenuto la loro forma durante l'imaging. I prodotti della radiolisi dell'acqua potrebbero ossidare i singoli atomi d'oro, alterando la forma delle nanoparticelle. In un altro esperimento, gli ioni cloruro vengono introdotti nella fase liquida.
Le nanoparticelle d'oro si sono lentamente dissolte attraverso l'esperimento mentre gli atomi d'oro ossidati formavano tetracloroaurato solubile. Per studiare i movimenti delle nanoparticelle d'oro nell'acqua, nell'esperimento successivo, le nanoparticelle non sono state completamente immobilizzate sulla membrana del campione. Le nanoparticelle d'oro si sono agglomerate e, una volta raggiunta una dimensione critica del cluster, si sono spostate fuori dal campo visivo.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Saranno necessarie diverse settimane di formazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare con calma e controllare la tenuta del vuoto e lo spessore del liquido.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in Scienza dei Materiali, Chimica e Biologia per esplorare la crescita e il movimento delle nanoparticelle nei liquidi, la struttura dei materiali su scala nanometrica in ambienti liquidi e la funzionalità delle proteine nelle cellule dei mammiferi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre la microscopia elettronica a scansione e trasmissione di nanoparticelle d'oro incorporate in uno strato d'acqua, incluso il corretto caricamento del portacampioni e la regolazione del microscopio. Non dimenticare che lavorare con liquidi nel microscopio elettronico può causare danni se il portacampioni non è caricato correttamente.
Quindi è importante verificare la presenza di perdite di vuoto prima del caricamento.
Panoramica
Questo protocollo descrive il funzionamento di un portacampioni a flusso liquido per la microscopia elettronica a trasmissione in scansione di AuNPs in acqua, facilitando l'osservazione di processi dinamici a scala nanometrica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia Elettronica a Trasmissione in Scansione
- Nanomateriali
- Immagini in Fase Liquida
Sfondo
- La microscopia elettronica a trasmissione in fase liquida consente l'osservazione di nanomateriali in un ambiente liquido.
- Questa tecnica fornisce informazioni morfologiche a scala nanometrica sui campioni.
- È particolarmente utile per lo studio di campioni biologici nel loro stato liquido naturale.
- Nei nuovi utenti, il caricamento del campione e l'acquisizione delle immagini possono risultare difficili.
Scopo dello studio
- Osservare le strutture e i fenomeni dei nanomateriali in campioni biologici.
- Studiare il comportamento dei nanomateriali in fase liquida.
- Migliorare la comprensione dei processi dinamici a livello nanometrico.
Metodi Utilizzati
- Pulizia e preparazione di microchip in SiN per il caricamento del campione.
- Applicazione di una soluzione di nanoparticelle d'oro sui microchip.
- Utilizzo di un portacampioni per TEM a flusso liquido per l'acquisizione delle immagini.
- Esecuzione di controlli di tenuta e verifica dell'allineamento corretto dei microchip.
Risultati principali
- Il protocollo dimostra con successo la preparazione e l'acquisizione di immagini di AuNPs in un ambiente liquido.
- Descrive i passaggi necessari per garantire l'integrità del campione durante il processo.
- I risultati indicano l'efficacia del portacampione a flusso liquido nel catturare processi dinamici.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni preziose sul comportamento dei nanomateriali in fase liquida.
- Migliora la capacità della microscopia elettronica nello studio di campioni biologici.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diversi settori della scienza dei materiali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microscopia elettronica a trasmissione in scansione in fase liquida consente l'osservazione diretta del comportamento dei nanomateriali in ambienti liquidi fisiologicamente rilevanti, supportando la validazione degli obiettivi attraverso la riduzione del rischio meccanicistica delle interazioni tra nanoparticelle e sistemi biologici. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici catturando processi dinamici come l'agglomerazione, la dissoluzione e l'assorbimento cellulare in condizioni di fluido controllate. Il metodo affronta una lacuna critica nello sviluppo della nanomedicina fornendo una risoluzione a scala nanometrica in stati idratati, riducendo la dipendenza da saggi inferenziali e migliorando le decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche visualizzando i cambiamenti strutturali dei nanomateriali in fase liquida, chiarificando i meccanismi d'azione e i percorsi di degradazione.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta delle interazioni tra nanoparticelle e componenti biologici in condizioni prossime a quelle native.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli identificando precocemente nanomateriali instabili o reattivi, riducendo il rischio di insuccessi in fasi avanzate dovuti a comportamenti imprevisti in fase liquida.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi confermando la stabilità e la dispersione dei nanomateriali nei mezzi liquidi prima dello screening ad alto contenuto informativo.
- Risultati quantitativi: Consente la misurazione delle variazioni nel tempo di dimensione, forma e concentrazione delle particelle, fornendo metriche riproducibili per la standardizzazione dei saggi.
- Riutilizzo della piattaforma: Favorisce la prontezza e la scalabilità dello screening attraverso la preparazione standardizzata di chip microfluidici e l'assemblaggio di supporti stagni, supportando l'uso ripetuto su diverse librerie di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mantenendo i nanomateriali in ambienti liquidi che imitano le condizioni fisiologiche, migliorando la rilevanza delle letture relative all'efficacia e alla tossicità.
- Decisioni Basate sul Rischio: Guida i criteri di avanzamento quantificando processi dinamici come la dissoluzione indotta da ioni o l'agglomerazione, che influenzano direttamente i profili di biodisponibilità e sicurezza.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra su un de-risking predittivo di tipo meccanicistico, chiarendo se gli effetti osservati derivino dal nanomateriale stesso o dai prodotti della sua trasformazione in fase liquida.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery all'Identificazione del Lead fino al lavoro Preclinico, sostenendo la verifica delle ipotesi, la preparazione dei saggi e la continuità traslazionale quando i nanomateriali vengono valutati in ambienti liquidi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo la visualizzazione diretta del comportamento dei nanomateriali in fase liquida, riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sull'interazione con il bersaglio.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la formazione riproducibile di celle liquide e l'immobilizzazione di nanoparticelle, garantendo condizioni iniziali costanti per la valutazione dei composti.
- Analisi: Evidenzia la misurazione dello spessore del liquido e il tracciamento delle nanoparticelle come parametri chiave che aiutano i gruppi a confrontare la stabilità tra diverse formulazioni o condizioni ambientali.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica mantenendo i nanomateriali in stati idratati che riflettono l'esposizione in vivo, favorendo l'allineamento dei biomarcatori quando i prodotti di dissoluzione o gli agglomerati si correlano con la risposta biologica.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile grazie a protocolli standardizzati di preparazione dei chip microfluidici, assemblaggio del supporto e test di tenuta, consentendo un'applicazione coerente tra progetti e team.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra nanomateriali e sistemi biologici.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle procedure di preparazione delle celle liquide e di acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione del progetto, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, grazie all'identificazione precoce di nanomateriali instabili.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio, basate sull'osservazione diretta della stabilità e delle trasformazioni in fase liquida.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di microfluidica, nei sistemi a vuoto e nella microscopia elettronica per garantire un corretto assemblaggio del portacampioni e i test di tenuta.
- È vincolato a strumentazioni quali pulitori al plasma, portacampioni per microscopia elettronica a trasmissione con flusso liquido e microscopi con capacità di microscopia elettronica a scansione dotati di portacampioni ambientali.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle procedure di pulizia dei chip, all'uso di distanziali e ai protocolli di portata, al fine di assicurare la riproducibilità tra diversi siti.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da mezzi a base acquosa a mezzi biologici complessi, inclusi gli effetti della viscosità e il possibile intasamento della membrana.
- Comprende limitazioni pratiche, come gli effetti di radiolisi indotti dal fascio sulla chimica del liquido e la necessità di compatibilità con il vuoto, che possono limitare l'uso di certe formulazioni volatili o reattive.
