Diagnostica di romanzo in artroplastica di Revisione: sonicazione e reazione a catena multipla della polimerasi dell'impianto

L'obiettivo generale delle procedure descritte, che includono l'aspirazione articolare, la reazione a catena della polimerasi multiplex e la sonicazione, è fornire risultati microbiologici rapidi e affidabili ai chirurghi ortopedici nei casi di sospetta infezione peri-protesica dell'articolazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo diagnostico e terapeutico dell'infezione peri-protesica dell'articolazione, come l'individuazione precoce dei patogeni e, di conseguenza, l'avvio tempestivo di un trattamento mirato. Il principale vantaggio di queste tecniche consiste nella rapidità di ottenimento dei risultati.

È in grado di accelerare la diagnosi differenziale nei casi di sospetta infezione articolare peri-protesica. Posizionare il paziente in posizione supina su un lettino di visita. Se si deve effettuare una puntura al ginocchio, posizionare un rullo sotto il ginocchio del paziente in modo che il ginocchio si trovi in una posizione leggermente flessa.

Utilizzare forbici elettriche per accorciare i peli corporali folti o lunghi. Quindi preparare il tavolo degli strumenti e indossare la tenuta chirurgica secondo il protocollo descritto nel testo. Successivamente, utilizzare un disinfettante per la pelle per lavare accuratamente la cute del paziente nel sito di puntura.

Con un telo sterile forato, coprire il sito di puntura. Identificare quindi il sito di puntura attraverso il telo. Utilizzando una lama appuntita di bisturi, praticare una piccola incisione a punta attraverso la cute nel sito di incisione.

Collegare la cannula al connettore luer-slip della siringa. Inserire quindi la cannula attraverso l'incisione a punta. Nella cavità superiore dell'articolazione del ginocchio, puntare con un angolo di 45 gradi in direzione dorsale e mediale verso la cavità, al di sotto del polo superiore della rotula, e inserire l'ago a una profondità di circa 5 cm.

Aspirare il liquido articolare tirando indietro il pistone della siringa. Per prevenire la formazione di ematomi, applicare una medicazione, seguita da una benda, sull'incisione da puntura. Utilizzare un disinfettante alcolico per disinfettare la membrana di un flacone per emocoltura pediatrica.

Quindi applicare una nuova cannula sulla siringa ed iniettare da 1 a 3 mL del liquido articolare aspirato nel flacone. Mescolare con un'agitazione delicata o una rotazione. Per preparare un campione nativo di aspirato articolare, rimuovere la cannula dalla siringa.

Quindi aprire un tubo per la raccolta del sangue senza additivi ed iniettare 1 mL di aspirato nel tubo di raccolta. Richiudere e fissare il coperchio per l'analisi PCR. Trasferire da 1 a 4 mL di aspirato articolare in un tubo per la raccolta del sangue contenente EDTA per il conteggio cellulare e la differenziazione.

Scongelare il tubo del master mix lasciandolo a temperatura ambiente. Trasferire 180 mcL del campione raccolto nel tubo del campione. Chiudere il tubo del campione con il tappo che contiene la proteina chinasi K e un gene di controllo interno per il controllo di qualità dell'intero flusso di lavoro.

Nella postazione di controllo, aprire il software di funzionamento toccando il pulsante Nuovo Test nell'angolo in basso a sinistra. Utilizzare lo schermo tattile per inserire i dati del paziente o un identificativo del campione. Per selezionare il campione dal menu a discesa, scegliere prima ITI Cartridge, quindi Ortopedia come modalità applicativa e infine selezionare Liquido Sinoviale o Liquido di Sonificazione come tipo di campione. Quindi premere il pulsante Avvia.

Scansionare il codice a barre situato sul fondo del tubo del campione. Quindi inserire il tubo del campione nel Lysator. Successivamente, selezionare il campione sullo schermo della postazione per sbloccare il tubo del campione dal Lysator.

Quindi rimuovere il tubo del campione dal Lysator e chiudere il coperchio superiore del Lysator. Trasferire il tubo del campione nello slot per il tubo del campione della cartuccia PCR. Inserire quindi il tubo del master mix scongelato nello slot del master mix della cartuccia PCR.

Seguire le istruzioni sul monitor della strumentazione per scansionare la cartuccia PCR con la miscela master e la provetta del campione. Inserire la cartuccia PCR nello slot per cartucce indicato dell'analizzatore. Sullo schermo tattile della strumentazione, nell'angolo in basso a sinistra, selezionare Test Attivi, quindi scegliere l'ID del campione corretto per visualizzare i risultati del test.

Salvare i risultati nella memoria della macchina e stamparli o esportarli per ulteriori riferimenti. Consultare il microbiologo e informarlo sui dettagli del caso, in modo che sia pronto ad analizzare i campioni tempestivamente. Sotto una cappa a flusso laminare, aprire il contenitore di plastica contenente la protesi asportata dalla sala operatoria e aggiungere soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% fino a coprire almeno l'80% del corpo estraneo asportato. Chiudere il contenitore di plastica.

Quindi agitare energicamente o mescolare il contenitore di plastica per 30 secondi. Trasferire il contenitore di plastica nel bagno a ultrasuoni. Successivamente, verificare il livello del liquido nel bagno.

Sonicare il campione per cinque minuti, con una frequenza di 40 ± 2 chilohertz e una densità di potenza di 0,22 ± 0,04 watt per centimetro quadrato. Successivamente, agitare o vorticare accuratamente il campione per 30 secondi. All'interno della cappa a flusso laminare, raccogliere 50 mL del liquido di sonicazione e trasferirlo in un tubo sterile prima di sigillare ermeticamente il tubo.

Per ottenere un fluido concentrato di sonificazione, centrifugare il tubo a 4200 ×g per 10 minuti, lasciando un volume residuo di 10 mL; utilizzare la pipetta per eliminare il soprannatante rimanente. Risospendere il pellet mediante pipettaggio e vortex. Inoculare ogni flacone di terreno di coltura idoneo con 0,5 mL di fluido concentrato di sonificazione.

Inoculare il flacone per emocoltura pediatrica con 2 mL di liquido di sonicazione concentrato, come dimostrato in precedenza in questo video. Successivamente, trasferire 1 mL di liquido di sonicazione concentrato in un tubo sterile senza additivi per l'analisi PCR. Trasferire il terreno di coltura inoculato nell'incubatrice.

Incubare le colture per 14 giorni e verificare la crescita quotidianamente. La presenza di un'infezione articolare periprotesica è stata considerata dimostrata quando era presente un criterio maggiore oppure almeno tre criteri minori su cinque. I criteri maggiori includono la presenza di una fistola o il rilevamento di un agente patogeno in due campioni microbiologici distinti.

I criteri minori includono un conteggio cellulare positivo o una differenziazione cellulare positiva nel liquido articolare prelevato mediante aspirato, un valore positivo di PCR e velocità di eritrosedimentazione nei campioni ematici, un'istologia positiva nei campioni tissutali oppure il rilevamento di un agente patogeno in un solo campione microbiologico. I risultati ottenuti hanno mostrato una sensibilità moderata per la diagnostica PCR del liquido di sonificazione e dell'aspirato articolare, ma una specificità molto elevata del 100%. Ogniqualvolta la PCR ha evidenziato un risultato positivo nell'aspirato articolare o nel liquido di sonificazione, lo stesso agente patogeno è stato successivamente rilevato in una delle colture microbiologiche convenzionali. La PCR eseguita sui diversi campioni provenienti da casi senza infezione non ha mostrato risultati falsamente positivi.

Six su 16 veri agenti patogeni nei campioni di liquido di sonicazione e cinque su 13 agenti patogeni provenienti dalla coltura del liquido articolare sono stati non rilevati dalla rilevazione PCR. La diagnostica PCR combinata di entrambi i materiali, liquido di artrocentesi e liquido di sonicazione, ha identificato correttamente 12 casi su 18 di infezione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come migliorare il vostro percorso diagnostico nell'infezione articolare periprotetica.

È possibile osservare quanto sia fondamentale una stretta collaborazione tra microbiologi e chirurghi ortopedici per migliorare al massimo le diagnosi differenziali. Se eseguita correttamente, questa procedura fornirà risultati clinicamente utili entro cinque ore dal prelievo articolare, grazie alla PCR multiplex basata su cartucce. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre condizioni sterili in ogni fase del processo.

Non dimenticare che lavorare con campioni di tessuto umano o campioni microbiologici può essere estremamente pericoloso. Tutte le precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.