Misurazione e modellazione contrattile asciugatura in Human strato corneo
1 marzo 2017
Questo articolo descrive un metodo per quantificare il comportamento dinamico di essiccazione e le proprietà meccaniche dello strato corneo misurando spazialmente risolta nel piano spostamenti di essiccazione dei campioni di tessuto circolari aderito ad un substrato elastomero. Questa tecnica può essere usata per misurare la diversa trattamenti chimici altera essiccazione e tissutali proprietà meccaniche.
L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare la rigidità meccanica dinamica e l'accumulo di tensioni durante l'essiccazione in campioni ex vivo del corneo umano, dopo diversi trattamenti chimici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei settori della biomeccanica e della scienza cosmetica, ad esempio in che modo la composizione del corneo o il trattamento del tessuto cutaneo con prodotti per la cura personale possano influenzarne le proprietà meccaniche e il comportamento dinamico durante l'essiccazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che offre un'alternativa più rapida rispetto ad altri metodi di valutazione meccanica, richiede una quantità significativamente inferiore di tessuto cutaneo e garantisce un'essiccazione più fisiologicamente rilevante impedendo l'evaporazione dalla superficie inferiore del campione.
Per preparare coprioggetti rivestiti con elastomero, preparare prima l'agente indurente Sylgard 184 mescolando la base solida con l'agente indurente in un rapporto di 55 a uno, fino a ottenere una miscela omogenea. Sono necessari in totale sei grammi. Successivamente, sottoporre la soluzione a degasaggio.
Quindi utilizzare la soluzione per rivestire le piastrine su un spin coater. Utilizzando una pipetta a largo foro, depositare un millilitro della miscela al centro di una piastrina. Successivamente, eseguire il rivestimento mediante spin coating della piastrina a 2.000 giri al minuto per 60 secondi.
Preparare in questo modo cinque o sei coprivetri rivestiti. Per polimerizzare i coprivetri, mantenerli in un forno a 60 gradi Celsius per 12 ore. Il giorno successivo, misurare lo spessore dei film di elastomero.
Utilizzare una lametta per sollevare un bordo del film di elastomero dal coprioggetto. Quindi, utilizzare un pennarello indelebile per contrassegnare il lato superiore del film di elastomero e per segnare il coprioggetto trattato sottostante. A questo punto, utilizzando un microscopio invertito, misurare l'altezza Z tra i piani focali dei segni per determinare lo spessore del film.
Seguire le procedure standard per preparare il tessuto SC. Per ottenere i campioni, effettuare prelievi di diametro pari a sei millimetri dallo strato corneo. Apporre quindi un segno al centro della faccia più esterna del campione utilizzando un pennarello indelebile. Successivamente, depositare delle microsfere fluorescenti sulla superficie dello strato corneo immergendo i campioni in 15 millilitri di acqua contenente circa 90 microlitri di concentrato di microsfere.
Agitare delicatamente per 30 minuti e regolare la concentrazione delle perle secondo necessità. Dopo il trattamento, immergere ogni campione in acqua per montarlo sull'elastomero. Posizionare un coprioggetto rivestito con un angolo ridotto, tra 15 e 30 gradi, sotto il campione cutaneo (SC) con l'elastomero rivolto verso il lato inferiore del SC. Sollevare quindi il coprioggetto dall'acqua con il campione cutaneo attaccato sopra, laminando in tal modo uniformemente il campione SC senza pieghe né aria intrappolata.
Successivamente, lasciare essiccare i campioni montati in condizioni ambiente per circa un'ora. Una volta essiccati, trasferire i campioni in una camera ermeticamente sigillata contenente un recipiente con acqua. Lasciare che i campioni raggiungano l'equilibrio con l'umidità per 24 ore.
Il giorno successivo, montare un campione su una camera di perfusione per una sessione di acquisizione prolungata. Posizionare la camera di perfusione sul substrato e sigillare i bordi della camera di perfusione all'elastomero utilizzando grasso da vuoto. Quindi acquisire immagini in fluorescenza e in luce trasmessa con un campo visivo sufficientemente ampio da includere l'intero campione di SC.
Nelle successive 16 ore, acquisire un'immagine ogni 10 minuti. In una cappa chimica, caricare un piccolo tappo di plastica con un millilitro di silano. Trasferire il tappo in un contenitore sigillato con un coprioggetto rivestito di elastomero, senza contatto diretto.
Lasciarli incubare a temperatura ambiente per cinque ore. Nel frattempo, preparare 20 millilitri di soluzione di perle seguendo il protocollo descritto nel testo e versarli in una piastra da 10 centimetri. Dopo cinque ore, posizionare lentamente i substrati silanati con il lato dell'elastomero rivolto verso il basso nella soluzione di perle.
Caricare due substrati in ogni piastra e lasciare che i substrati reagiscano con le perle per 45 minuti. Successivamente, utilizzando pinzette, rimuovere i substrati e risciacquarli in acqua distillata per eliminare le perle non legate. Quindi asciugarli sotto un flusso delicato di aria compressa e conservarli in una scatola sigillata e opaca.
Utilizzando la tecnica precedentemente descritta, trasferire i campioni di SC su un substrato trattato in un bagno d'acqua. Immediatamente dopo aver montato il campione di SC, applicare una goccia di cinque microlitri di soluzione concentrata di microsfere fluorescenti. Successivamente, lasciare asciugare il campione di SC per 60 minuti.
Ora, misurare lo spessore dello strato corneo (SC) utilizzando il microscopio con un obiettivo 40x in una camera di perfusione. Misurare lo spessore dello strato corneo nel tempo, utilizzando un accessorio per messa a fuoco remota per registrare la differenza di altezza in Z tra i due strati di microsfere. Un livello si trova all'interfaccia tra lo strato corneo e il substrato, l'altro è posto sulla superficie superiore dello strato corneo. Utilizzando le tecniche descritte, è stato preparato un campione di strato corneo e rivestito con microsfere fluorescenti.
Dopo 16 ore di essiccazione a umidità relativa del 25%, sono stati misurati gli spostamenti. A causa della simmetria circolare dei campioni, questi spostamenti sono stati mediati in senso azimutale. Durante tutto il processo di essiccazione, gli spostamenti azimutali rimangono ridotti.
I profili di spostamento radiale, tuttavia, sono aumentati in modo monotono dal centro verso il bordo e hanno incrementato la loro entità fino al raggiungimento di un equilibrio. I profili registrati a intervalli di 30 minuti mostrano l'evoluzione temporale degli spostamenti nel piano. Lo spessore medio della SC è diminuito durante l'essiccazione, principalmente nelle prime due ore.
La dinamica dell'essiccazione è stata quindi analizzata adattando i profili di spostamento a un modello di contrattilità lineare ed elastico, utilizzando un approccio ai minimi quadrati. Dal modello sono stati ricavati lo stress di essiccazione contrattile e il modulo elastico. Entrambi i parametri sono aumentati rapidamente nelle prime due ore di essiccazione.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di aderire completamente i campioni sul substrato. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la colorazione dei lipidi per rispondere a ulteriori domande, ad esempio come determinati trattamenti cosmetici alterino la composizione lipidica del tessuto.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per quantificare la rigidità meccanica dinamica e il comportamento di essiccazione del corneo umano. Misurando gli spostamenti planari di essiccazione di campioni di tessuto su un substrato di elastomero, la tecnica valuta come i trattamenti chimici influenzano le proprietà del tessuto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomeccanica
- Scienza Cosmetica
Sfondo
- Comprendere le proprietà meccaniche dello strato corneo è fondamentale per le applicazioni di trattamento della pelle.
- I metodi attuali possono richiedere più tessuto o tempo rispetto a quanto desiderato.
- Il comportamento dinamico dell'essiccazione può influenzare l'efficacia dei prodotti per la cura personale.
Scopo dello studio
- Quantificare le sollecitazioni da essiccazione e la rigidità meccanica in campioni di pelle es vivo.
- Valutare l'impatto di diversi trattamenti chimici sulle proprietà della pelle.
- Fornire un'alternativa rapida ai metodi esistenti di valutazione meccanica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di coprioggetti rivestiti con elastomero utilizzando Sylgard 184.
- Misurazione degli spostamenti di essiccazione risolti nello spazio.
- Valutazione delle proprietà meccaniche dopo il trattamento.
- Prevenzione dell'evaporazione dal lato inferiore del campione per rilevanza fisiologica.
Risultati principali
- Il metodo consente una valutazione rapida delle proprietà meccaniche della pelle.
- Diversi trattamenti chimici alterano in modo significativo il comportamento durante l'essiccazione.
- È richiesta una quantità minore di tessuto rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora la comprensione della biomeccanica della pelle.
- Fornisce informazioni sugli effetti dei prodotti cosmetici sulla pelle.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la formulazione e l'efficacia dei prodotti.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una valutazione rapida e fisiologicamente rilevante delle proprietà meccaniche dello strato corneo in condizioni di essiccazione, supportando la valutazione iniziale di formulazioni cosmetiche e per la cura personale. Quantificando le variazioni dinamiche dello stress da essiccazione e del modulo elastico, fornisce indicazioni predittive sulla funzione barriera e sulla resilienza del tessuto, orientando le decisioni di sviluppo del prodotto. L'approccio ad alto rendimento e con ridotta richiesta di tessuto migliora l'efficienza dello screening e riduce la dipendenza da saggi meccanici tradizionali.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga in che modo i trattamenti cosmetici alterano le proprietà biomeccaniche dello strato corneo, supportando la verifica di ipotesi meccanicistiche.
- Valore operativo: Consente un'analisi rapida degli effetti delle formulazioni sulla rigidità del tessuto e sullo stress da essiccazione, con consumo minimo di campione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi di spostamento con risoluzione spaziale che si correlano alle variazioni delle proprietà meccaniche durante l'essiccazione.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione e la misurazione mediante campioni circolari fissati a un elastomero, migliorando la riproducibilità tra i diversi gruppi sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega le variazioni indotte dalla formulazione nel comportamento di essiccazione all'integrità della barriera, sostenendo la rilevanza traslazionale per gli esiti legati alla salute della pelle.
- Valore operativo: Fornisce un monitoraggio continuo dell'evoluzione meccanica durante cicli di essiccazione di 16 ore, consentendo una valutazione dell'efficacia risolta nel tempo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro delle prime fasi di scoperta, in cui l'impatto della formulazione sulla biomeccanica della pelle viene valutato prima dell'ottimizzazione del composto leader, creando un collegamento tra il screening molecolare e la valutazione funzionale del tessuto.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come i prodotti per la cura personale influenzino la meccanica dello strato corneo e l’accumulo di stress indotto dall’essiccazione.
- Screening: Fornisce costrutti tessuto-elastomero standardizzati pronti per i saggi, adatti al confronto multiplo in schermate di formulazioni.
- Analisi: Estrae lo stress da essiccazione e il modulo elastico da profili di spostamento interpolati, consentendo un confronto quantitativo degli effetti dei trattamenti nel tempo.
- Ricerca Translazionale: Collega la dinamica meccanica dell’essiccazione alla funzione barriera, fornendo indicazioni sulla rilevanza preclinica degli interventi cosmetici.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare diversi attivi cosmetici, idratanti e detergenti in condizioni controllate di essiccazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile degli effetti delle formulazioni sulla resistenza meccanica del tessuto e sul comportamento di essiccazione legato alla barriera.
- Valore operativo: Elevata produttività, basso consumo di tessuto e prevenzione di artefatti da evaporazione migliorano l'affidabilità e la scalabilità del saggio.
- Valore strategico: Permette una riduzione precoce dei rischi associati ai candidati formulativi identificando quelli che aggravano lo stress meccanico indotto dall'essiccazione.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli ingredienti cosmetici in base alla compatibilità biomeccanica con lo strato corneo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Competenze nella modellazione biomeccanica e nell'analisi delle immagini per il tracciamento degli spostamenti e l'adattamento del modello.
- Accesso a centrifughe per rivestimenti, camere di perfusione e controllo ambientale per l'essiccazione regolata dall'umidità.
- Standardizzazione delle procedure di perforazione dei tessuti, marcatura con microsfere e rivestimento con elastomero tra diversi utilizzatori.
- Considerazioni adattative per diversi spessori del tessuto o compliance del substrato quando si estende l'applicazione oltre lo strato corneo umano.
- Limitazione pratica: il metodo presuppone un comportamento elastico lineare e simmetria circolare, ipotesi che potrebbero non essere valide in condizioni patologiche o in tessuti fortemente alterati.
