L'uso di traccia Eyeblink condizionamento classico per valutare la disfunzione Hippocampal in un modello del ratto dei disturbi dello spettro fetale alcol

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare come l'utilizzo del condizionamento classico del battito palpebrale mediante traccia, una forma di apprendimento associativo, possa aiutare a rilevare disfunzioni dell'ippocampo in un modello ratto dei disturbi dello spettro alcolico fetale. I ratini neonati vengono sottoposti a una dose elevata di alcol, con una concentrazione del 11,9% volume/volume di alcol, in modo simile a un'assunzione binge, durante il periodo equivalente al terzo trimestre umano per quanto riguarda la crescita cerebrale.

Questo schema di esposizione e dose di alcol costituisce un fattore chiave nella produzione di deficit cerebrali durante l'arco della vita, simile ai casi umani di FASD. Una regione cerebrale importante compromessa dall'esposizione precoce all'alcol è l'ippocampo. Dopo che i ratti sono cresciuti fino all'età adulta, vengono esaminati per valutare la disfunzione ippocampale mediante condizionamento classico del riflesso palpebrale di tipo "trace".

Si tratta di una forma avanzata di apprendimento associativo che dipende dall'integrità dell'ippocampo. Durante i giorni postnatali da quattro a nove, i cuccioli di ratto vengono pesati ogni mattina e i loro pesi vengono registrati. I volumi di alimentazione vengono quindi ottenuti da una tabella prestampata in base al peso corporeo.

Una soluzione alcolica al 11,9% volume/volume viene somministrata a dei ratto nati da poco in due somministrazioni distanziate di due ore. La dose alcolica giornaliera totale è di 5,25 grammi per chilogrammo al giorno. Questo paradigma di esposizione binge somministra 0,278 millilitri di alcol per grammo di peso corporeo per ogni somministrazione in soluzione di latte.

Estrarre il latte contenente alcol utilizzando una siringa sterile da un millilitro. Quindi espellere la soluzione in eccesso per ottenere la quantità esatta necessaria. Immergere la punta del tubo PE-10 nell'olio di mais fresco.

Questo facilita l'inserzione. Misurare la lunghezza del tubo PE-10 dalla bocca del cucciolo fino allo stomaco. Se necessario, regolare il tappo PE-50 in modo che funga da guida visiva per il punto di arresto.

Inserire con attenzione il tubo PE-10 in bocca al cucciolo. Generalmente si incontrerà una certa resistenza quando la punta raggiunge la gola. Manovrare il tubo fino a quando la punta si piega all'ingresso dell'esofago.

Cercare di non far scivolare indietro il tubo, poiché potrebbe essere scivoloso a causa dell'olio. Procedere lungo l'esofago e, quando la punta supera lo sfintere gastroesofageo, entrerà nello stomaco. Fermarsi a questo punto, stabilizzare la pompa ed erogare la soluzione.

Questa operazione deve essere eseguita lentamente. Rimuovere con attenzione il tubo PE-10 ed esaminare il cucciolo per verificare la presenza di reflusso della soluzione, sangue o lesioni fisiche. Se il cucciolo è in buone condizioni, riposizionarlo insieme ai suoi simili della nidiata.

Fare riferimento al protocollo scritto e all'elenco dei materiali per gli strumenti specifici utilizzati nella procedura chirurgica delle palpebre. Sterilizzare il campo operatorio con un disinfettante approvato e sottoporre a sterilizzazione in autoclave tutti gli strumenti e i materiali chirurgici con sufficiente anticipo. Dopo aver indotto un'adeguata anestesia nel ratto mediante isoflurano, rasare la testa utilizzando un tagliacapelli per peli, esponendo una quantità sufficiente di cute per il sito dell'incisione e per la palpebra sinistra.

La sua cute viene sterilizzata eseguendo tre passaggi alternati con alcol isopropilico al 70% e iodopovidone. Seguire la procedura standard per fissare il ratto al dispositivo stereotassico utilizzando le barre auricolari. Procedere con l'intervento chirurgico quando il ratto mostra un adeguato piano anestetico.

Utilizzare la lama del bisturi per effettuare un'incisione antero-posteriore lungo la linea mediana. Questa incisione deve esporre una superficie sufficiente in regione anteriore agli occhi e leggermente posteriore alla linea lambdoidea. Utilizzare la lama del bisturi per raschiare con cura il periostio situato sulla sommità del cranio, evitando di provocare un sanguinamento eccessivo.

Rimuovere con un bastoncino di cotone l'eccesso di tessuto connettivo e sangue e sciacquare la zona con soluzione salina sterile tra una raschiatura e l'altra. Praticare un foro a partire immediatamente dietro la sutura coronale su un osso parietale. Rimuovere qualsiasi traccia di sangue e detriti ossei con un bastoncino di cotone.

Utilizzare pinzette a becco per afferrare una vite 0 80. Utilizzare un cacciavite da orafo per avvitare la vite nel foro, serrando leggermente la vite senza danneggiare il tessuto cerebrale corticale, solitamente con tre o quattro giri completi. Seguire la stessa procedura per fissare le rimanenti viti.

Dovrebbero essere presenti due viti fissate bilateralmente dietro la sutura coronale e una sull'osso parietale destro, anteriormente alla sutura lambda. Afferrare la pelle superiore nel sito dell'incisione dell'occhio sinistro con la pinza per medicazioni da quattro pollici e indirizzare la pinza per medicazioni da tre pollici verso l'angolo di questo occhio. Prendere un ago da 26 gauge lungo 3/8 di pollice e inserirlo nell'angolo della palpebra.

Ruotare l'ago in modo che il lato smussato sia rivolto verso l'alto. Inserire il secondo ago al centro della palpebra. Utilizzare pinzette fini per afferrare un filo 3T e inserirlo in uno dei due aghi.

Non è necessario inserirlo completamente. Seguire la stessa procedura per il secondo filo 3T. Afferrare entrambi gli aghi con una mano mentre si tiene lo stadio della testa con l'altra mano.

In un unico movimento continuo, allontanare gli aghi dalla palpebra guidando contemporaneamente il supporto della testa nella stessa direzione. Tenendo con una mano il supporto della testa per l'EMG, utilizzare con l'altra mano la pinza per medicazioni da tre pollici per avvolgere il filo da 10T intorno a una o entrambe le viti sul lato destro. Riporre bene questo filo in modo che non sporga dalle viti.

La testa del dispositivo EMG deve essere posizionata al centro prima di passare al passaggio successivo. Utilizzare la pinza chirurgica da quattro pollici per creare una piccola tasca separando la cute, ossia la fascia superficiale, dal muscolo temporale. Una volta creata la tasca, utilizzare le forbici ad iris per rimuovere ulteriore tessuto connettivo, procedendo verso l'angolo dell'occhio sinistro.

Attenzione a non andare troppo in profondità o a recidere vasi sanguigni. Prendere un elettrodo bipolare e modellare il cavo in modo che possa adattarsi alla curvatura del muscolo temporale. I due rebbi saranno posizionati posteriormente all'occhio sinistro e l'estremità inferiore dell'elettrodo bipolare sarà posizionata esattamente sulla sommità del cranio.

Mescolare la polvere di Ortho Jet con i componenti liquidi fino a ottenere una consistenza liquida. Applicare la pasta con una spatola microscopica intorno all'intera area dell'incisione. Prestare attenzione a non far cadere alcuna pasta sugli occhi del ratto e mantenerla confinata.

Lasciare che l'Ortho Jet raggiunga uno stato semi asciutto, quindi utilizzare la pinzetta per rimuovere l'eccesso di acrilico sulla piattaforma della testa EMG e sui filetti dell'elettrodo bipolare. Tagliare il filo 3T in eccesso, lasciando alcuni centimetri per lavorare.

Rimuovere con attenzione la schermatura in PTFE da ciascun filo 3T utilizzando la pinzetta microchirurgica. Questo consente loro di entrare in contatto con il muscolo orbicolare dell'occhio. Utilizzare la pinzetta microchirurgica per creare dei ganci su ciascuna estremità dei fili 3T.

Tagliare il filo in eccesso, avendo cura di non rimuoverne troppo in modo che il filo rimanente non si ritiri all'interno della palpebra. I cavi sono prodotti in laboratorio. Innanzitutto viene collegato il connettore bipolare bianco, che permette l'erogazione dello stimolo US di shock.

Successivamente viene collegato il connettore arancione del modulo di testa EMG, che registra l'attività elettromiografica durante l'ammiccamento del ratto. Entrambi i connettori sono collegati a un commutatore circolare nella parte superiore del braccio, il quale mantiene la continuità del segnale mentre il ratto si muove liberamente.

Si accende l'isolatore dello stimolo e si effettuano i controlli finali dell'apparecchiatura. Questo include la regolazione della linea di base dell'EMG a un livello visibile sullo schermo del computer. Nella prima sessione, l'intensità dello shock viene inizialmente impostata a 4 milliampere e sarà aumentata di 4 milliampere ogni due prove.

Questa procedura di introduzione graduale permette a un ratto di abituarsi allo stimolo elettrico. All'ottavo tentativo, l'intensità dello shock viene mantenuta a 1,6 milliampere per tutta la sessione e per tutte le sessioni successive. Un computer separato gestisce un oscilloscopio digitale a quattro canali che ci consente di eseguire diagnosi in tempo reale dei segnali.

Notare lo sbattere di palpebre emesso dal ratto nella scatola uno. L'oscilloscopio indica anche che il segnale EMG di base è relativamente pulito e con rumore basso. Le webcam ci permettono inoltre di monitorare ciascun ratto.

Questa è una schermata del software blink versione 4.0 che mostra un'epoca sperimentale della durata di 1400 millisecondi. Nei primi 280 millisecondi, non vengono presentati stimoli al fine di ottenere una misura dell'attività EMG di base. La linea gialla indica la soglia, al di sopra della quale qualsiasi risposta EMG che superi di 4 volt il valore medio di baseline pre-CS sarà considerata una risposta di ammiccamento.

Lo stimolo condizionato tonale di 85 decibel viene somministrato al punto temporale di 280 millisecondi. Il tono rimane attivo per 380 millisecondi, corrispondenti al punto temporale di 660 millisecondi. Dopo lo spegnimento, vi è un intervallo di 500 millisecondi durante il quale non vengono presentati stimoli. Questo periodo è chiamato periodo di traccia, durante il quale il ratto deve associare la cessazione dello stimolo condizionato tonale con l'inizio dello stimolo incondizionato rappresentato dalla scossa, che verrà ancora somministrata al punto temporale di 1160 millisecondi.

Lo shock US dura 100 millisecondi. Naturalmente, lo shock US provoca una risposta difensiva di battito delle palpebre nota come risposta incondizionata, o UR, che viene misurata in una finestra temporale di 140 millisecondi. Una sessione di allenamento consiste in 100 prove.

Ci sono 90 prove in cui il CS e il US sono abbinati e ogni dieci prove, viene somministrato solo il CS. Ci sono 10 prove con solo il CS per sessione. Queste prove ci permettono di verificare se avviene l'apprendimento dell'associazione tra CS e US.

Sotto forma di risposte condizionate, o CR, che si manifestano quando lo stimolo incondizionato (US) dello shock non è presente. L'intervallo inter-trial è mediamente di 30 secondi, in modo che l'inizio di ogni prova non sia prevedibile. Durante una qualsiasi prova, un ratto può ammiccare in qualsiasi momento e il suo EMG verrà registrato dal software.

Ogni ammiccamento oculare discreto che supera la linea di soglia sarà considerato una risposta in una delle quattro categorie in base al momento in cui si verifica e all'epoca della prova. Se il ratto ammicca durante i primi 80 millisecondi successivi all'inizio del tono CS, la risposta è considerata una risposta di startle o SR. Si tratta di una risposta non associativa indicativa della prestazione sensoriomotoria, ma non dell'apprendimento dell'associazione CS-US in sé. Se ammicca dopo il periodo SR ma prima della somministrazione dello shock US, allora ha emesso una risposta condizionata.

Come menzionato in precedenza, la risposta condizionata (CR) è la misura principale dell'apprendimento associativo. Non ci si aspetta che la CR si sviluppi nelle fasi iniziali dell'addestramento, ma man mano che l'addestramento prosegue attraverso numerose prove e sessioni, questi tipi di risposte diventano più frequenti, di maggiore ampiezza e possono presentare un tempismo migliore. Suddividiamo le risposte condizionate in due tipi: risposte condizionate totali e risposte condizionate adattative.

I CR totali riflettono la capacità generale di apprendimento, mentre i CR adattivi riflettono la capacità dell'animale di sincronizzare bene il battito di ciglia. Immediatamente prima dell'inizio dello stimolo avversivo, come modo per prepararsi, il periodo del CR adattivo è di 200 millisecondi prima dell'inizio dello stimolo avversivo (US). Nei mammiferi con un ippocampo integro, l'espressione dei CR adattivi riflette un coinvolgimento avanzato dell'ippocampo nella temporizzazione accurata del battito di ciglia in relazione alla somministrazione dei due stimoli.

Per sua natura, il condizionamento classico dell'ammiccamento in traccia è molto più difficile da acquisire rispetto al condizionamento classico dell'ammiccamento di ritardo, in cui il CS tonale e l'US da shock si sovrappongono nel tempo. Sebbene l'espressione delle CR possa variare da soggetto a soggetto e possa essere gravemente influenzata da alterazioni di specifici circuiti cerebrali, ci si aspetta che l'UR venga emessa durante ogni prova accoppiata CS-US. Pertanto, questa misura riflette la performance sensoriomotoria e, come le risposte di startle, non indica in sé l'apprendimento dell'associazione CS-US.

Nella seguente serie di brevi video, verrà mostrata la configurazione del software e l'inizio dell'addestramento al battito delle palpebre. Il software per il battito delle palpebre viene attivato e vengono caricati i due file pertinenti: un file ratto contenente i dati del soggetto e il file per il condizionamento del battito delle palpebre di tipo trace.

Il programma è impostato in anticipo prima dell'inizio dell'addestramento. Quando l'addestramento ha inizio, si noti che nell'angolo in basso a destra dello schermo è presente un timer che indica il conteggio alla rovescia per il prossimo tentativo. Di seguito è riportata una registrazione video in tempo reale della sessione uno, tentativo 15, in cui viene emessa una risposta incondizionata (UR), ma non si sono ancora sviluppate risposte condizionate (CR).

Ecco una riproduzione a un terzo della velocità. Nella seguente serie di clip, verranno mostrati screenshot dallo stesso ratto di controllo non intubato mentre prosegue attraverso sei sessioni di addestramento. Alla fine emette sia risposte condizionate totali che risposte condizionate adattative.

Di seguito è riportato un filmato in tempo reale della sesta sessione, prova 96, in cui vengono emessi due ammiccamenti, uno è una risposta condizionata adattativa (CR) e l'altro una risposta incondizionata (UR). Ecco una riproduzione a un terzo della velocità originale. In questo ultimo filmato si osserva un ratto intubato con alcol durante l'ultima prova della sesta sessione, una prova con solo lo stimolo condizionato (CS); anche dopo 600 prove di addestramento, non emette in modo affidabile una risposta condizionata adattativa (CR). Dopo la raccolta dei dati, questi vengono esaminati per identificare prove non valide, caratterizzate da artefatti di rumore elevato o da un'attività EMG anomala nella fase basale precedente allo stimolo condizionato (CS), utilizzando un algoritmo integrato per il rilevamento di valori anomali.

I trial validi che vengono conservati vengono ulteriormente analizzati per SR, UR, CR totali e CR adattivi in relazione alla percentuale di risposte, ampiezza, latenza e altre misure critiche. La media dei CR adattivi su sei sessioni di allenamento è mostrata in questo primo insieme di risultati. Sia la percentuale che le misure di ampiezza sono risultate statisticamente significative tra il gruppo sottoposto a intubazione con alcol e i due gruppi di controllo dalla seconda alla sesta sessione.

Ciò indica che la frequenza e l'intensità delle risposte condizionate adattative erano compromesse nei ratti esposti all'alcol durante lo sviluppo precoce. Le risposte incondizionate medie sono mostrate in questo secondo insieme di risultati. Sia la frequenza che le misure di ampiezza non presentavano differenze statisticamente significative tra nessuno dei gruppi.

Questi risultati indicano che l'esposizione precoce all'alcol non ha compromesso la capacità dei ratti di ammiccare in risposta allo stimolo incondizionato, ma che il deficit osservato era dovuto a un'incapacità di associare correttamente lo stimolo condizionato (CS) e lo stimolo incondizionato (US) durante la fase di acquisizione. In questo esperimento, abbiamo esaminato la relazione tra cervello e comportamento determinando se un'esposizione allo sviluppo all'alcol somministrata in modo simile a un binge influisca sull'ippocampo, come evidenziato da deficit nel condizionamento classico del riflesso palpebrale a traccia. In effetti, il condizionamento classico del riflesso palpebrale rappresenta uno strumento utile per valutare le conseguenze neurocomportamentali associate all'esposizione all'alcol durante lo sviluppo cerebrale.

È molto versatile in quanto, modificando i parametri dello stimolo o i requisiti dell'apprendimento associativo, è possibile valutare anche l'integrità funzionale di diversi sistemi cerebrali al di fuori dell'ippocampo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione delle complessità legate alla somministrazione di alcol ai ratti neonati, all'innesto di elettrodi e all'esecuzione della procedura di test del riflesso palpebrale. Vi ringraziamo per aver guardato questo video.