Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi
1 novembre 2017
Formazione immagine della vivere-cella è un potente strumento per la visualizzazione di processi dinamici. L'esame delle cellule fisse fornisce solo immagini statiche, che possono portare a interpretazioni erronee e confusione circa il processo. Questo lavoro presenta un metodo per studiare l'assorbimento, rilascio di farmaci e localizzazione intracellulare di nanoparticelle liposomiale in cellule viventi.
L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging su cellule vive è seguire processi cellulari come l'assorbimento e la distribuzione di Agenti Chemioterapici senza la necessità di fissazione. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro, ad esempio: come gli Agenti Chemioterapici, sia in forma libera che incapsulati in nanoparticelle, vengono assorbiti dalle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che stiamo effettuando l'imaging di cellule vive, prevenendo così gli artefatti da fissazione e permettendo una valutazione dinamica in tempo reale.
L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo osservato che le nanoparticelle si degradavano durante la fissazione, portando a un'errata interpretazione del rilascio del farmaco. Per assemblare la camera di imaging, posizionare un vetrino da 25 millimetri nella parte inferiore della camera e avvitare la parte superiore a quella inferiore. Non stringere eccessivamente, poiché il vetro potrebbe rompersi.
Autoclavare l'intera camera. Per seminare le cellule, rimuovere la camera di imaging dalla busta di sterilizzazione all'interno di una cappa a flusso laminare. Stringere con cura la camera e posizionarla in una piastra di Petri.
Rivestire il vetro della camera di imaging con un millilitro di gelatina sterile allo 0,1 percento per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 5 percento di anidride carbonica. Dopo aver rimosso il mezzo dai flaconi di coltura cellulare, lavare le cellule una volta con PBS 1x e staccare le cellule utilizzando tripsina allo 0,25 percento. Inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura cellulare.
Quindi, raccogliere le cellule e centrifugarle a 1.100 G per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare. Dopo aver contato le cellule come descritto nel protocollo testuale, aspirare la gelatina e seminare le cellule in una diluizione che consenta una copertura massima del 70 percento entro 24 ore.
Lasciare che le cellule aderiscano in un'atmosfera con il cinque percento di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius per 24 ore. Valutare le cellule al microscopio per verificarne la confluenza, la morfologia cellulare e la presenza di contaminazioni. Successivamente, accendere il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.
Collegare il riscaldatore dell'obiettivo all'obiettivo e impostarlo a 35 gradi. Preparare l'unità di incubazione come indicato nel protocollo del testo. Posizionare l'unità di incubazione sul palchetto del microscopio e collegare i tubi di entrata e uscita dell'anidride carbonica.
Aprire la valvola principale dell'anidride carbonica e accendere il regolatore di anidride carbonica. Verificare che il regolatore sia impostato al cinque percento di anidride carbonica. Condizioni appropriate di coltura cellulare come temperatura, CO2, pH, umidità e sterilità sono fondamentali per l'acquisizione di immagini cellulari a lungo termine.
Pertanto, ogni incubatore deve essere opportunamente testato. Impostare la temperatura della piastra a 37 gradi Celsius. Attendere che l'unità di incubazione raggiunga la temperatura selezionata e la percentuale di anidride carbonica.
Prendere la camera di imaging dall'incubatore principale a anidride carbonica e trasportare la camera nella sala di microscopia utilizzando una piastra di Petri. Posizionare la camera di imaging in un supporto personalizzato per piastre da 35 millimetri e chiudere la camera con un coperchio sigillante su misura. Aprire l'unità di incubazione e, lavorando il più rapidamente possibile per evitare il raffreddamento delle cellule, sostituire la patch rossa con la camera di imaging e quindi chiudere l'unità.
Assicurarsi che nessun cavo sia incastrato tra la piastra e il microscopio. Lasciare che l'apparecchiatura si acclimati per 30 minuti. Successivamente, aprire il software e accendere il laser.
Crea un nuovo database cliccando su "Nuovo" nella scheda File. Assegna un nome e salva il database. Imposta la configurazione cliccando su "Configura" nella scheda Acquisisci.
Selezionare "Modalità canale" e "Traccia singola" per valutare un singolo fluorocromo. Selezionare "Traccia multipla" per più fluorocromi. Quindi, scegliere i filtri passa-banda appropriati, abbinandoli al fluorocromo.
Selezionare il canale a campo chiaro in una delle tracce. La scansione rappresenta un compromesso tra il segnale fluorescente dei composti e la qualità dell'immagine. Saturazione, fotodegradazione, rapporto segnale-rumore, qualità delle cellule e composti aggiunti sono tutti fattori che possono influenzare i risultati e devono essere adeguatamente testati.
Impostare il controllo di scansione facendo clic su "Scansione" nella scheda Acquisisci. Quindi fare clic su "Modalità" per impostare le dimensioni del fotogramma, la velocità di scansione, la direzione di scansione e la media della scansione. Fare clic su "Canali" per impostare il pinhole, il guadagno e l'offset, e la potenza del laser.
Salvare queste impostazioni facendo clic su Config nella scheda Configurazione e salvarle nel database di configurazione. Impostare l'intervallo temporale facendo clic su Muti TimeX nella scheda Macro. Fare clic su Singola Posizione.
Applicare la configurazione salvata cliccando su Singola Traccia e scorrere fino alla configurazione richiesta nel database delle configurazioni. Impostare l'intervallo di tempo e il numero di scansioni. Caricare la configurazione cliccando su Carica Config.
Assegnare un nome al time-lapse nel campo Nome file di base e selezionare il database cliccando su Database immagini per salvare il time-lapse. Impostare una cartella temporanea cliccando su Cartella immagini temporanea. Successivamente, aprire l'unità di incubazione, sollevare l'anello di imaging, aggiungere una goccia di olio di immersione all'obiettivo e richiudere l'unità il più rapidamente possibile. Mettere a fuoco e selezionare una posizione nella camera di imaging.
Nella cappa a flusso laminare, diluire il farmaco libero o le nanoparticelle a una concentrazione di cinque microgrammi per millilitro di farmaco oppure 0,05 micromoli di lipidi nel mezzo di coltura cellulare. Filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron se il farmaco o le nanoparticelle non sono sterili. Aprire la camera di incubazione e sollevare il coperchio superiore.
Quindi, rimuovere il mezzo dalle cellule, aggiungere un millilitro di farmaco o nanoparticelle diluite e chiudere l'unità il più rapidamente possibile. Concentrarsi sulle cellule ed eseguire una scansione rapida cliccando su "Singola" nella scheda Controllo Scansione. Quando l'immagine in campo chiaro mostra le cellule a fuoco, avviare la ripresa temporale cliccando su "Avvia Tempo" nel Macro Multi TimeX.
Il numero di ripetizioni e il tempo rimanente sono mostrati nel Macro e nelle immagini. Verificare periodicamente se le cellule sono ancora a fuoco, oppure utilizzare l'autofocus. Il programma salva automaticamente il time-lapse nel database.
Non chiudere il database mentre il programma è in esecuzione. Questo è un time-lapse di tre ore di cellule esposte alla doxorubicina libera. Osservare l'assorbimento e il traslocazione immediata della doxorubicina fluorescente rossa nel nucleo.
Qui, le cellule sono incubate per tre ore con Doxorubicina encapsulata. Il segnale fluorescente è molto più debole e si trova nel citoplasma. Il segnale è appena visibile nel nucleo.
Trasferendo questi filmati a intervalli fissi a Image J, è possibile disegnare una regione di interesse attorno al nucleo e misurare la densità dei pixel. Il grafico qui presentato mostra la differenza nell'assorbimento nucleare nel tempo in cellule incubate con doxorubicina libera o incapsulata. Qui mostrate sono cellule incubate con doxorubicina incapsulata, indicate in rosso.
Il segnale viola rappresenta il veicolo e i lisosomi sono colorati con un marcatore verde per cellule vive. Il confronto tra i due tipi cellulari mostra una differenza nella distribuzione lisosomiale. Nei lisosomi delle cellule B16BL6, la distribuzione avviene in tutta la citoplasma.
Nei confronti, i lisosomi nelle cellule BLM si trovano vicino al nucleo. Tuttavia, entrambe le linee cellulari mostrano un'elevata colocalizzazione del segnale rosso e viola nei lisosomi, indicando che la doxorubicina e il suo veicolo sono intrappolati in questi organelli. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come effettuare l'immagine dell'assorbimento di agenti chemioterapici e altri marcatori fluorescenti in cellule vive per diverse ore o anche giorni.
Panoramica
Questo studio presenta una tecnica di imaging su cellule vive per visualizzare in tempo reale l'assunzione e la distribuzione di agenti chemioterapici. Evitando gli artefatti da fissazione, il metodo consente un'osservazione accurata dei processi di somministrazione del farmaco in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Neuroscienze
- Ricerca sul Cancro
Sfondo
- L'immagine in tempo reale su cellule vive fornisce informazioni dinamiche sui processi cellulari.
- L'immagine su cellule fissate può portare a interpretazioni errate dei meccanismi di somministrazione dei farmaci.
- I nanoparticelle possono degradarsi durante la fissazione, complicando l'analisi.
- L'acquisizione d'immagini in tempo reale è essenziale per comprendere le interazioni farmacologiche nella terapia del cancro.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per monitorare l'assunzione di agenti chemioterapici in cellule vive.
- Valutare la distribuzione di nanoparticelle senza artefatti da fissazione.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di somministrazione dei farmaci nelle cellule tumorali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una camera per imaging per l'osservazione di cellule vive.
- Coltura cellulare in condizioni controllate (temperatura, CO2, umidità).
- Utilizzo della microscopia confocale per monitorare i processi cellulari.
- Acquisizione di immagini in lapse temporale per catturare i cambiamenti dinamici nel tempo.
Risultati principali
- Visualizzazione con successo dell'assorbimento e della distribuzione del farmaco in tempo reale.
- Dimostrati i vantaggi dell'imaging su cellule vive rispetto ai metodi su cellule fissate.
- Forniti approfondimenti sul comportamento dei nanoparticelli all'interno di cellule vive.
- Consentita l'osservazione delle risposte cellulari all'esposizione al farmaco.
Conclusioni
- L'immagineggiatura di cellule vive è uno strumento prezioso per lo studio dei meccanismi di somministrazione dei farmaci.
- Il metodo riduce il rischio di interpretazioni errate associate alla fissazione.
- Applicazioni future potrebbero migliorare le strategie di trattamento del cancro.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'immagine in tempo reale di cellule vive permette il tracciamento in tempo reale dell'assorbimento di nanoparticelle chemioterapiche e del loro traffico intracellulare, affrontando una lacuna critica nello sviluppo di farmaci oncologici in cui gli artefatti da fissazione oscurano gli eventi dinamici di rilascio del farmaco e di translocazione nucleare. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo dati quantitativi risolti nel tempo sulla cinetica di rilascio del farmaco e sulla localizzazione subcellulare, informando direttamente l'ottimizzazione del composto leader e la selezione del candidato preclinico. Visualizzando il destino dei nanocarrier a base lipidica all'interno di cellule tumorali vive, il metodo aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, riducendo l'abbandono tardivo dovuto a meccanismi d'azione mal compresi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'osservazione diretta del rilascio dell'agente chemioterapico dai nanocarrier e della successiva translocazione nucleare, chiarificando il legame meccanicistico tra somministrazione e attività biologica.
- Valore operativo: Elimina gli artefatti indotti dalla fissazione che alterano l'integrità dei nanoparticelle e la distribuzione del farmaco, garantendo un'interpretazione accurata dei profili di assorbimento e rilascio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera misurazioni quantitative dell'intensità di fluorescenza nel tempo, consentendo il confronto tra la cinetica di farmaci liberi e di farmaci incapsulati in un contesto fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la valutazione di sistemi di somministrazione di farmaci a base di nanoparticelle in condizioni di cellule vive, favorendo la scalabilità del saggio e il riutilizzo tra diversi progetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la degradazione del nanocarrier e il rilascio del farmaco alla colocalizzazione lisosomiale e all'accumulo nucleare, fornendo un biomarcatore traslazionale per la disponibilità intracellulare del farmaco.
- Valore operativo: Facilita decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, visualizzando se i farmaci incapsulati raggiungono un'adeguata consegna al nucleo necessaria per indurre gli effetti farmacologici previsti, riducendo l'incertezza meccanicistica nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della molecola bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, in cui la visualizzazione in tempo reale del rilascio del farmaco e della distribuzione subcellulare fornisce informazioni per stabilire relazioni struttura-attività e ottimizzare la progettazione dei nanoveicoli prima dei test di efficacia preclinica.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla stabilità dei nanocarrier, alla cinetica di rilascio del farmaco e ai percorsi di traffico intracellulare, consentendo l'osservazione diretta della translocazione della doxorubicina dal citoplasma al nucleo.
- Screening: Fornisce letture quantitative pronte per saggi sull'assorbimento del farmaco e sull'accumulo nucleare nel tempo, permettendo il confronto diretto di variabili formulative in condizioni cellulari vive identiche.
- Analisi: Fornisce dati di intensità fluorescente in funzione del tempo provenienti da regioni di interesse definite (ad esempio, nucleo, lisosomi), consentendo il confronto statistico dell'efficienza di consegna del farmaco tra agenti liberi e agenti incapsulati in nanoparticelle.
- Ricerca Translazionale: Collega il comportamento dei nanocarrier in cellule vive agli esiti farmacologici successivi, correlando i modelli di traffico lisosomiale con la disponibilità del farmaco nel nucleo, sostenendo decisioni di avanzamento allineate ai biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Rappresenta una capacità di imaging modulare applicabile su diverse piattaforme di nanoparticelle e agenti chemioterapici, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante e consentendo screening meccanicistici su tutta la linea di prodotti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sul meccanismo d'azione del farmaco rivelando il rilascio in tempo reale del farmaco e la sua translocazione nucleare, riducendo l'ambiguità nell'interazione con il bersaglio e nell'attivazione delle vie metaboliche.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso la preparazione standardizzata delle camere, il controllo ambientale e parametri di acquisizione delle immagini, minimizzando la variabilità negli studi longitudinali su cellule vive.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale identificando precocemente i nanoveicoli non funzionali, evitando investimenti in sistemi di somministrazione che non rilasciano il farmaco attivo nel sito d'azione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei candidati nanoveicoli sulla base del dimostrato rilascio intracellulare del farmaco e della sua consegna al nucleo, allineando lo sviluppo alla validità meccanicistica.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging di cellule vive, nella microscopia confocale e nell'acquisizione temporale per mantenere la vitalità cellulare e l'integrità del segnale per periodi prolungati.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi sistemi di incubazione con controllo di temperatura e CO2, laser confocali e rivelatori sensibili per il tracciamento di nanoparticelle a basso segnale.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nelle procedure di preparazione delle cellule, nei dosaggi farmacologici e nei protocolli di imaging, al fine di garantire la comparabilità tra studi e sedi differenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse linee cellulari, dimensioni delle nanoparticelle ed etichette fluorescenti, poiché i rapporti segnale-rumore e le soglie di fototossicità variano in base alle condizioni sperimentali.
- I limiti pratici includono il rischio di fotodegradazione durante l'imaging a lungo termine e la necessità di un'accurata ottimizzazione della potenza del laser e della velocità di scansione per bilanciare qualità del segnale e salute cellulare.
