Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare popolazioni putative di cellule staminali tumorali in campioni biologici in base alla capacità delle cellule della popolazione laterale di espellere coloranti. Questo metodo affronta una domanda fondamentale nella ricerca sulle cellule staminali tumorali riguardo a mezzi affidabili per il rilevamento e la purificazione delle cellule staminali tumorali da campioni biologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza marcatori funzionali, fornendo quindi una risoluzione migliore.

Inoltre, l'espressione di questi trasportatori di farmaci ABC è altamente conservata tra le cellule staminali tumorali e pertanto possiamo utilizzare questa tecnica per molte diverse entità tumorali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta di terapie antitumorali mirate alle cellule staminali tumorali, poiché facilita analisi successive come il profilo di espressione genica e la validazione di bersagli in cellule tumorali altamente purificate. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali.

È inoltre possibile utilizzare questo metodo per caratterizzare sistemi costituiti da popolazioni cellulari esprimenti trasportatori di farmaci ABC, come il midollo osseo. A illustrare la procedura sarà Elisabeth Hoflehner, una tecnica del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare la linea cellulare tumorale umana desiderata a 37 gradi Celsius in 10-30 millilitri di mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FBS, L-glutamina 2 millimolare e antibiotici.

Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa il 70-90%, rimuovere il mezzo e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA 0,05% per staccare le cellule dalla superficie della piastra di coltura. Successivamente, lavare le cellule con 10 millilitri di mezzo di coltura, trasferire la sospensione in un tubo pulito da 15 millilitri e centrifugare a 250 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Una volta che le cellule sono state pellettizzate, eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di coltura.

Mescolare un'aliquote piccola della sospensione cellulare con soluzione di blu di tripano e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per preparare i campioni di prova, sospendere le cellule in mezzo di coltura fresco per ottenere una sospensione cellulare di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Dopo aver aggiustato la densità cellulare, trasferire tre millilitri del campione in un tubo con fondo rotondo da 15 millilitri etichettato come prova.

Quindi, aggiungere 10 micromolar del colorante viola al campione e vortexare delicatamente la sospensione. Successivamente, preparare i controlli di inibizione trasferendo 500 microlitri della sospensione cellulare contenente il colorante in due provette per citometria a flusso etichettate come controllo. Aggiungere 50 micromolar di Verapamil al primo.

Aggiungere 20 micromolar di Fumitremorgin C al secondo tubo. Mescolare le soluzioni pipettando delicatamente. Coprire tutti i tubi con i tappi e incubarli a 37 gradi Celsius al buio per 90 minuti.

Agitare delicatamente i campioni ogni 15 minuti. Al termine della colorazione, lavare i controlli di inibizione con tre o quattro millilitri di PBS freddo di ghiaccio. E preparare aliquote del campione in esame per la successiva colorazione con anticorpi.

Lavare anche queste aliquote e filtrare tutti i campioni attraverso setacci con dimensione di taglio di 70 micron per rimuovere eventuali aggregati cellulari. Quindi, centrifugare le sospensioni a 250 × g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver risospeso il pellet risultante in 100 microlitri di PBS, mantenere le cellule sul ghiaccio, protette dalla luce.

Successivamente, aggiungere un'adeguata serie di anticorpi coniugati con fluorocromi alle cellule precedentemente colorate con il colorante violetto. Vortexare le sospensioni e incubarle a quattro gradi celsius al buio per 20-30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con tre-quattro millilitri di PBS ghiacciato e filtrare il campione se desiderato.

Quindi, centrifugare a 250 × g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule pellettizzate in 100 microlitri di PBS. Infine, aggiungere il 7-AAD alle cellule precedentemente colorate con il colorante violetto.

E incubare i campioni per cinque-dieci minuti al buio. Per analizzare le cellule utilizzando il citometro a flusso, selezionare una popolazione cellulare appropriata su un grafico a dispersione FSC SSC. Successivamente, utilizzando diversi segnali FSC, escludere dalla popolazione selezionata tutti gli aggregati cellulari.

Escludere le cellule che mostrano una colorazione positiva per il 7-AAD al fine di ottenere la popolazione di cellule vitali. Per creare un diagramma a dispersione per l'emissione del colorante blu e rosso, visualizzare il canale fluorescente blu sull'asse y e il canale fluorescente rosso sull'asse x. Impostare entrambi i canali in modalità lineare e regolare opportunamente la tensione del rivelatore in modo che la popolazione laterale si trovi nella parte inferiore sinistra del grafico.

Quindi, selezionare la popolazione laterale. E arrestare l'acquisizione. Successivamente, caricare i controlli di inibizione e acquisire i dati.

Infine, creare un dot plot che mostri la fluorescenza rossa del colorante violetto sull'asse delle x e un canale di fluorescenza appropriato sull'asse delle y, rappresentato in modalità logaritmica. Caricare il campione, quindi regolare le tensioni dei rivelatori di conseguenza e identificare la frazione di cellule della popolazione laterale che esprimono la superficie in esame. Successivamente, registrare i dati.

Di seguito sono riportati risultati rappresentativi dell'analisi della popolazione laterale eseguita su cellule tumorali ovariche umane. La popolazione laterale, distinta mediante l'analisi dell'emissione blu e rossa-violetta, è stata identificata nel quadrante inferiore sinistro del diagramma a dispersione e costituiva lo 0,70% dell'intera popolazione analizzata. L'utilizzo successivo di inibitori dell'efflusso ha determinato la scomparsa del segnale di fluorescenza osservato nelle cellule precedentemente identificate, confermando il loro fenotipo di popolazione laterale.

Infine, le cellule ovariche umane sono state anche caratterizzate in termini di espressione di ABCG2. Una colorazione positiva per ABCG2 è stata osservata nello 0,67% delle cellule, corrispondente alla popolazione laterale identificata. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere eseguita in circa due o tre ore se svolta correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che il fenotipo della popolazione laterale dipende strettamente da un rapporto ottimale tra concentrazione del colorante e densità cellulare. È pertanto fortemente raccomandata l'ottimizzazione di entrambe le variabili prima dell'esperimento. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come il profilo dell'espressione genica, al fine di caratterizzare ulteriormente le cellule della popolazione laterale e quindi identificare nuovi bersagli specifici delle cellule staminali tumorali per lo sviluppo futuro di farmaci.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare le caratteristiche delle cellule staminali dei tessuti e delle cellule staminali tumorali, sia nei topi che negli esseri umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire l'analisi della popolazione laterale attivata dal colorante violetto e su come rilevare le presunte cellule staminali tumorali in campioni biologici nel tuo laboratorio. Ricorda che lavorare con campioni biologici può essere estremamente pericoloso e che è necessario adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI) e di cappe a sicurezza biologica quando si esegue questa procedura.