Vivere-cella misura di Odorant recettore attivazione mediante un'analisi di campo in tempo reale
2 ottobre 2017
Che caratterizzano la funzione dei recettori odorant serve una parte indispensabile nel processo di deorphanization. Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di recettori di odorizzante in tempo reale usando un'analisi di campo.
L'obiettivo generale di questo saggio AMP ciclico ad alto rendimento in tempo reale è quello di selezionare gli odorosi rispetto ai recettori degli odori e viceversa. Poiché i topi sono utili per studiare il funzionamento del recettore degli odori, in quanto consentono screening su larga scala sia dei recettori degli odori che dei ligandi, nonché cartelizzazioni farmacologiche di una coppia recettore-ligando di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo valutare l'attivazione odorizzante-recettore in modo efficiente e affidabile.
Sistema di espressione eterologo odorante-recettore che utilizza cellule vive. Inizia osservando le cellule Hana3A con un microscopio a contrasto di fase per garantire la vitalità cellulare e stimare la confluenza. Quindi aspirare tutto il terreno dalla piastra di coltura cellulare.
E lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato sulla piastra, facendo roteare il piatto e aspirando il PBS. Quindi, aggiungi i tre millilitri di tripsina-EDTA allo 0,5% sulla piastra. Lasciare la tripsina sulle cellule per un minuto o fino a quando tutte le cellule sono a galla.
Inattivare la tripsina aggiungendo 5 millilitri di MEM con il 10% di FBS e pipettando su e giù per rompere pezzi di massa cellulare. Dopo aver eseguito la conta delle cellule, trasferire 2x10 alla sesta cella per piastra da 96 pozzetti da trasfettare in una provetta da 15 millilitri. È importante calcolare il numero corretto di cellule da preparare su una piastra a 96 pozzetti per evitare una crescita eccessiva o insufficiente di cellule prima della stimolazione.
Centrifugare le provette a 200 volte G per cinque minuti. E poi aspirare il surnatante senza disturbare il pallet cellulare. Aggiungere sei millilitri di terreno senza antibiotici per ogni piastra a 96 pozzetti e pipettare su e giù senza creare bolle d'aria per rompere pezzi di massa cellulare.
Trasferire le celle sospese in un serbatoio. Utilizzando una pipetta multicanale, pipettare 50 microlitri di cellule in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Prima della trasfezione, osservare le cellule piastrate al microscopio a contrasto di fase per garantire una corretta confluenza di circa il 30-50% per pozzetto, quindi rimetterle nell'incubatore. Seguire il costrutto da odorante a recettore etichettato in riga, i costrutti del fattore accessorio e il costrutto della variante del biosensore AMP ciclico. Quindi preparare una miscela di trasfezione al plasma in 500 microlitri di MEM per ogni piastra a 96 pozzetti.
Successivamente, preparare una miscela di trasfezione contenente 18 microlitri di reagente di trasfezione mediata da lipidi in 500 microlitri di MEM. Miscelare la miscela di trasfezione con la miscela di plasma pipettando verso l'alto e verso il basso. Quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 5 millilitri di MEM con il 10% di FBS alla miscela di trasfezione. Quindi, stendere uno spesso strato di carta assorbente sterile nella cappa per colture cellulari. Prelevare una piastra a 96 pozzetti con cellule dall'incubatore.
Delicatamente e ripetutamente, picchiettare il piatto a testa in giù sulla pila di carta assorbente in modo che il supporto venga completamente assorbito dal tovagliolo di carta. Trasferire 50 microlitri della miscela di trasfezione combinata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e incubare per una notte per 18-24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. È possibile gestire la trasfezione e il programma di stimolazione dovrebbe persistere sullo strumento per più di una piastra a 96 pozzetti testata in un esperimento in modo che tutte le piastre vengano specchiate dopo la stessa trasfezione e intervallo di esposizione dei distillatori.
Prima della stimolazione, osservare le cellule trasfettate al microscopio a contrasto di fase per garantire una corretta confluenza del 50-80% per pozzetto prima di rimetterle nell'incubatore. Quindi preparare il terreno di stimolazione aggiungendo 10 mucchi millimolari e cinque millimolari di glucosio alla soluzione salina bilanciata di Hanks. Scongelare 55 microlitri di alloquat del substrato del saggio AMP ciclico in tempo reale su ghiaccio.
Preparare una soluzione di abrasione uguale al 2% mescolando 55 microlitri di reagente del substrato e 2.750 microlitri di terreno di stimolazione. Dopo aver steso uno spesso strato di carta assorbente sul banco, picchiettare delicatamente e ripetutamente la piastra capovolta sui tovaglioli di carta in modo che il mezzo di trasfezione venga assorbito dai tovaglioli di carta. Lavare le cellule pipettando 50 microlitri di terreno di stimolazione in ciascun pozzetto.
Picchiettare delicatamente e ripetutamente il mezzo di stimolazione dalla piastra a 96 pozzetti. Pipettare 25 microlitri di soluzione equillibrante al 2% in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente al buio per due ore. Prima della fine del tempo di incubazione, diluire le soluzioni madre odorizzanti scongelate al mezzo di concentrazione e stimolazione di lavoro.
Prima dell'aggiunta dell'odorizzante, utilizzare un lettore di piastre a chemiluminescenza per misurare il livello di luminescenza basale della piastra. Rimuovere rapidamente la piastra dal lettore di piastre e aggiungere 25 microlitri di diluizioni odorizzanti a ciascun pozzetto. Quindi avviare immediatamente la misurazione continua della luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 minuti.
379 recettori odorosi umani unici sono stati sottoposti a screening rispetto a 30 musconi micromolari utilizzando il saggio AMP ciclico in tempo reale. I blocchi colorati lungo l'asse X indicano diverse famiglie di recettori degli odori umani. L'asse Y rappresenta la luminescenza normalizzata 30 minuti dopo l'aggiunta dell'odorizzante, quando la risposta ha raggiunto il massimo per il controllo positivo.
La risposta di OR5AN1 è indicata. Questa figura mostra le misurazioni in tempo reale dell'attivazione di OR5AN1 da parte di diverse concentrazioni di muscone e il risultato di un controllo negativo senza odore. La freccia indica il punto temporale dell'aggiunta di oderant.
Qui, viene mostrata una curva concentrazione-risposta di OR5AN1 contro muscone 30 minuti dopo l'aggiunta di oderante. La tecnica qui descritta richiede un totale di tre giorni a partire da una piastra di riserva di livelli di coltura il primo giorno. Una volta padroneggiato, il processo dell'ultimo giorno può essere completato in tre ore per ogni piastra da 96 pozzetti, se viene eseguito correttamente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire l'attivazione dei recettori oderanti utilizzando un test AMP ciclico per sfruttare i risultati.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per la misurazione in tempo reale dell'attivazione dei recettori odorosi mediante un saggio dell'AMP ciclico. La tecnica consente uno screening efficiente di odoranti su recettori, sfruttando i vantaggi di un sistema di espressione eterologa.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia olfattiva
- Farmacologia
Sfondo
- I recettori degli odori svolgono un ruolo fondamentale nel senso dell'olfatto.
- Comprendere l'attivazione dei recettori è essenziale per la deorfanizzazione.
- I topi sono comunemente utilizzati per lo studio delle funzioni dei recettori degli odori.
- I saggi in tempo reale aumentano l'efficienza dei processi di screening.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per lo screening di odoranti.
- Valutare l'attivazione dei recettori per gli odoranti in tempo reale.
- Facilitare la caratterizzazione farmacologica di coppie recettore-legante.
Metodi Utilizzati
- Saggio in tempo reale ad alta capacità per l'AMP ciclico.
- Sistema di espressione eterologa mediante cellule vive.
- Osservazione delle cellule Hana3A per vitalità e confluenza.
- Screening di odoranti contro recettori per gli odoranti.
Risultati principali
- Il saggio consente una valutazione affidabile dell'attivazione da parte di odoranti del recettore.
- È stata ottenuta una selezione efficiente sia di recettori che di ligandi.
- Il metodo favorisce indagini su scala più ampia.
- La vitalità cellulare è stata confermata prima dell'esperimento.
Conclusioni
- Questo metodo migliora la comprensione delle funzioni dei recettori degli odori.
- Fornisce una piattaforma affidabile per studi farmacologici.
- L'approccio può essere applicato a diverse interazioni recettore-legando.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo saggio in tempo reale dell'AMP ciclico consente lo screening ad alto rendimento dei recettori odoranti, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella deorfanizzazione dei bersagli olfattivi. Fornendo letture quantitative e in tempo reale dell'attivazione del recettore, supporta la validazione precoce del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico nei programmi di scoperta in neuroscienze e biologia sensoriale. Il metodo aumenta la fiducia predittiva sulle interazioni recettore-legante, informando le decisioni di portafoglio per i programmi sui bersagli olfattivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Scoperta e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando l'esposizione a odoranti a risposte specifiche di AMPc mediati da recettori.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di recettori orfani attraverso profili di attivazione dipendenti dalla dose.
- Valore traslazionale: Genera dati concentrazione-risposta utili a valutare la fiducia sul bersaglio e a prioritizzare i composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce output di luminescenza normalizzati che permettono il confronto diretto della potenza degli odoranti tra diverse famiglie di recettori.
- Valore operativo: Consente lo screening riproducibile, su piastre, di librerie chimiche contro panel di recettori in un formato a 96 pozzetti.
- Valore di scalabilità: Compatibile con esecuzioni su più piastre, supportando campagne a medio rendimento per la scoperta di ligandi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'attivazione del recettore alla segnalazione a valle, fornendo un'analisi meccanicistica dei percorsi di trasduzione olfattiva.
- Valore traslazionale: Genera dati farmacologicamente rilevanti (EC50, efficacia) che possono guidare strategie di biomarcatori nei disturbi sensoriali.
- Allineamento preclinico: Utilizza una libreria di recettori umani in una linea cellulare mammifera, aumentando la rilevanza per la biologia umana.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio dopo il clonaggio del recettore e prima dell'ottimizzazione del composto attivo, fornendo una conferma funzionale dell'interazione recettore-ligando.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi biologiche sulla specificità dei recettori e sull'attivazione dei ligandi in un contesto cellulare vivente.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative e in tempo reale dell'AMP ciclico che consentono l'identificazione e il ranking dei composti attivi.
- Analisi: Offre profili di luminescenza normalizzati e profili cinetici che supportano il confronto tra pozzetti e tra piastre.
- Ricerca traslazionale: Utilizza recettori odorosi umani in cellule Hana3A, migliorando la rilevanza per la funzione olfattiva umana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di svariati bersagli chemiosensoriali al di là dell'olfatto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'attivazione del recettore misurando in tempo reale la produzione del secondo messaggero.
- Valore operativo: Standardizza le condizioni del saggio tra diverse piastre, migliorando la riproducibilità e riducendo la variabilità nelle campagne di screening.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo go/no-go sulla validità del bersaglio confermando precocemente le risposte funzionali durante la fase di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento proporzionato al rischio eliminando i non rispondenti e concentrando le risorse su coppie recettore-legante validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare di mammiferi, nella trasfezione e nella gestione di saggi su cellule vive.
- Richiede l'utilizzo di lettori di piastre a luminescenza in grado di effettuare misurazioni cinetiche a intervalli di 30 minuti.
- Necessita della standardizzazione dell'efficienza di trasfezione e del grado di confluenza cellulare tra i diversi pozzetti per ottenere segnali affidabili.
- Richiede l'ottimizzazione della solubilità e della diluizione degli odoranti nel mezzo di stimolazione per evitare artefatti.
- Limitato ai recettori accoppiati a Gs che modulano l'AMPc; non applicabile ai percorsi accoppiati a Gi o Gq senza adattamento del biosensore.
