Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare i siti di integrazione di vettori retrovirali derivati dal virus della leucemia murina per definire regioni regolatorie specifiche per cellula. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali negli studi di terapia genica e regolazione genica, come ad esempio in quale punto del genoma umano il vettore si integra e quale elemento regolatorio può essere attivamente utilizzato attraverso un particolare sottotipo. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica osservando che negli studi di terapia genica, i vettori MLV si integrano in promotori ed enhancer attivi e specifici per sottotipo.

Iniziare trasducendo le cellule bersaglio con un vettore retrovirale derivato da MLV che contiene il gene reporter EGFP e pseudotipizzato con VSV-G o con la glicoproteina dell'involucro amphotropica. Le cellule trasdotte in modo fittizio vengono utilizzate come controllo negativo. 48 ore dopo la trasduzione, centrifugare i campioni e quindi risospendere 100.000 cellule in 300 microlitri di PBS contenente il due percento di siero fetale bovino.

Quindi, misurare l'espressione di EGFP mediante analisi citometrica in flusso. Raccogliere da 0,5 a cinque milioni di cellule transdotte per la preparazione del DNA genomico e la successiva digestione con enzimi di restrizione. Impostare quattro digestioni con enzimi di restrizione per ogni campione in provette da 1,5 millilitri.

Digerire da 0,1 a un microgrammo di G-DNA in ogni provetta. Aggiungere 10 unità di TRU91 e un microlitro di buffer M per campione in un volume finale di 10 microlitri. Distribuire due microlitri della miscela in provette per la digestione.

Quindi incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Al termine dell'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua in un tubo da 1,5 millilitri. Nello stesso tubo, aggiungere 10 unità di PST1 e un microlitro di buffer H per ogni campione.

Distribuire 10 microlitri della miscela di reazione di digestione nei tubi per la digestione. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Il giorno successivo, preparare otto reazioni di ligazione dei linker in tubi da 1,5 millilitro.

Per ogni reazione, aggiungere la miscela di reazione della ligasi a 10 microlitri di DNA genomico digerito. Incubare a 16 gradi Celsius per tre-sei ore. Per la PCR del primo ciclo, preparare 48 reazioni di PCR in provette da 0,2 millilitri.

Per ogni PCR, aggiungere la miscela di reazione contenente il primer linker e il primer MLV3 prime LTR a due microlitri della reazione di ligazione. Posizionare i campioni in un termociclatore con coperchio riscaldato. Impostare i parametri di ciclizzazione ed eseguire la prima reazione PCR.

Per la PCR del secondo ciclo, preparare la miscela di reazione includendo il primer nested del linker e il primer nested del LTR 3' dell'MLV. Quindi, aggiungere due microlitri del prodotto PCR ottenuto dalla PCR del primo ciclo come stampo. Successivamente, eseguire la reazione PCR del secondo ciclo per generare i prodotti finali di PCR LN.

Dopo la PCR del secondo ciclo, raccogliere le 48 reazioni di PCR LM nidificate in un tubo da 15 millilitri. Quindi aggiungere 20 microlitri di buffer di caricamento a 100 microlitri del prodotto PCR LM raccolto e precipitato. Caricare il campione su un gel di agarosio all'uno percento insieme al marcatore di DNA da 100 paia di basi.

Eseguire l'elettroforesi a cinque volt per centimetro per 30-60 minuti; una volta risolte le bande, ritagliare la porzione di gel contenente ampliconi lunghi da 500 a 150 paia di basi. Dopo aver purificato il prodotto della PCR LM mediante un kit di estrazione su colonna con gel, misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV prima di procedere alla preparazione della libreria. Inoltre, valutare la lunghezza dei prodotti della PCR LM utilizzando uno strumento bioanalizzatore seguendo le istruzioni del produttore.

Preparare la libreria impostando una PCR di indicizzazione. Per ogni PCR, utilizzare da 150 a 170 nanogrammi di prodotto PCR LM purificato, con combinazioni di indici diverse per ogni campione. Eseguire la PCR in un termociclatore con coperchio riscaldato come indicato.

Dopo la PCR, diluire la libreria purificata a 10 nanomolari con tris HCl 10 millimolari. Successivamente, mescolare cinque microlitri del pool diluito con cinque microlitri di idrossido di sodio 0,2 normali in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Vortexare brevemente, centrifugare e quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie.

Posizionare i tubi del pool denaturato sul ghiaccio e aggiungere 990 microlitri di tampone di ibridazione HT1 preraffreddato. Quindi, aliquotare 300 microlitri di pool denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitro e aggiungere 300 microlitri di HT1 preraffreddato per ottenere un pool di libreria finale di dieci picomolari.

In parallelo, mescolare 10 nanomolar di libreria di controllo fissata in un volume di due microlitri con 3 microlitri di tris HCl 10 millimolare in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio 0,2 newton e vortexare brevemente. Dopo aver centrifugato, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare il fissativo diluito.

Dopo l'incubazione, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 990 microlitri di HT1 pre-raffreddato. Ora, aliquotare 100 microlitri di fix denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitro e aggiungere 300 microlitri di HT1 pre-raffreddato per ottenere una concentrazione finale di 10 picomolari di fix. Infine, in un nuovo tubo da 1,5 millilitro, mescolare 510 microlitri del pool di librerie denaturato con 90 microlitri di libreria fissa denaturata, ottenendo così un pool finale di 10 picomolari con il 15% di controllo di fix da sottoporre a sequenziamento.

Questa immagine mostra l'analisi di 3498, 2989 e 4103 cluster di siti di integrazione ricorrenti del virus della leucemia murina (MLV) rispettivamente in cellule staminali progenitrici ematopoietiche, progenitori eritroidi e progenitori mieloidi. In ciascuna popolazione cellulare, oltre il 95% dei cluster di MLV si sovrapponeva a enhancer e promotori definiti epigeneticamente. Le regioni bersaglio specifiche per ogni tipo cellulare erano altamente acetilate e associate all'espressione specifica della cellula del gene bersaglio.

Esempi sono il promotore del gene SPINK2 specifico per HSP. La regione di controllo del locus contenente potenti enhancer dei geni della globina simile al beta specifici per gli eritroidi. Enhancer localizzati a monte del gene LYZ specifico per NPP.

I saggi del reporter luciferasi hanno convalidato il sottoinsieme di enhancer specifici per la cellula e bersagliati dal MLV in EPP e MPP. Le regioni bersagliate dal MLV specifiche per l'eritroide mostravano un'attività maggiore in EPP rispetto a MPP e viceversa, confermando che il MLV identifica enhancer specifici per la cellula che potrebbero controllare l'espressione di geni vicini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di massimizzare la frequenza di cellule transdotte per un recupero ottimale dei siti di integrazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mappare i siti di integrazione virali, partendo dall'adattamento del DNA genomico, seguito dalla ligazione dei frammenti genomici con un linker di DNA, quindi dall'amplificazione della giunzione tra genoma dell'ospite e genoma virale mediante PCR-LM e infine dal sequenziamento in profondità della libreria di ampliconi.