Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids
11 agosto 2017
Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.
L'obiettivo generale di questa metodologia di bioprinting microfluidico è quello di generare un costrutto di tessuto vascolarizzato. Questo metodo può risolvere problemi chiave nella biofabbricazione di tessuti vascolarizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è versatile nel generare una vasca vascolare tridimensionale a forma controllata per l'ingegnerizzazione di tessuti vascolarizzati attraverso un processo di semina cellulare secondaria.
Sebbene questo protocollo fornisca informazioni sull'ingegnerizzazione dei tessuti cardiaci vascolarizzati, può essere applicato anche a molti altri tipi di tessuto come fegato, pelle e persino tumori. Le persone generiche che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché l'impostazione del bioprinter potrebbe non essere semplice. Per iniziare questa procedura, costruire una testina di stampa microfluidica concentrica a doppio strato inserendo un ago smussato più piccolo, che funge da nucleo, al centro dell'ago smussato più grande, che funge da guaina.
Assicurarsi che l'ago centrale sporga dal guscio esterno di circa un millimetro. Dopodiché inserire un ago calibro 23 nella canna dell'ago centrale nella direzione opposta. Fai un foro sul lato del fusto dell'ago esterno e inserisci un connettore metallico della stessa dimensione.
Sigillare con colla epossidica. Montare l'estrusore sulla testina di una biostampante, utilizzando un supporto in polimetilmetacrilato o PMMA. Successivamente, per l'iniezione del bioink e della soluzione reticolante attraverso due tubi in PVC singolarmente, collegare gli ingressi della testina di stampa a una pompa siringa a doppio canale.
Prepara il bioink usando una miscela di alginato, gelMA e fotoiniziatore. Disciolto in tampone HEPES da 25 millimolari, contenente il 10% di siero fetale bovino o FBS. Quindi preparare una soluzione di cloruro di calcio 0,3 molare in tampone HEPES contenente il 10% di FBS che funge da fluido trasportatore di reticolazione.
Subito prima del bioprinting, tripsinizzare le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o HUVEC per 5-10 minuti. Centrifugare le celle a 800 giri/min per cinque minuti in una provetta da 15 millilitri. Risospendere le cellule nel bioink a una concentrazione da cinque a 10 volte da 10 a sei cellule per millilitro pipettando lentamente da cinque a 10 volte.
Successivamente, utilizzare una pompa a siringa a doppio canale per avviare l'iniezione del bioink HUVEC attraverso uno e del fluido reticolante attraverso l'altro canale a una velocità di flusso di cinque microlitri al minuto. Lasciare che i flussi scorrano continuamente per un massimo di un minuto fino a quando non si stabilizzano. Successivamente, avviare il movimento della testina di stampa mantenendo la velocità di deposizione della biostampante di circa quattro millimetri al secondo.
Questo bioprinting dovrebbe portare a una rapida gelificazione ionica del componente alginato e alla deposizione di un'impalcatura in microfibra. Dopo che l'impalcatura è stata stampata, reticolare fotograficamente il componente gelMA con 5-10 milliwatt per centimetro quadrato di luce UV per 20-30 secondi per ottenere la gelificazione chimica. Quindi rimuovere il cloruro di calcio in eccesso dall'impalcatura risciacquandolo delicatamente con PBS caldo a 37 gradi Celsius.
Coltiva questa impalcatura in un terreno di crescita delle cellule endoteliali a 37 gradi Celsius in una percentuale di CO2 del cinque in volume, per un massimo di 16 giorni. Cambiare il mezzo almeno ogni due giorni. Durante il periodo di coltura, monitorare gli HUVEC al microscopio fino a quando non migrano verso le periferie delle microfibre dell'impalcatura e formano strutture simili a lumi.
Quindi rimuovere con cautela l'intero mezzo dallo spazio intrastiziale dell'impalcatura con forza capillare utilizzando un pezzo di carta da filtro sterile. Aggiungere istantaneamente una goccia di sospensione di un tipo di cellula secondaria come i cardiomiociti sulla parte superiore dell'impalcatura, consentendo alle cellule di infiltrarsi nell'intero spazio intrastiziale. Dopodiché, incubare questa impalcatura in un'incubatrice per 30 minuti o due ore, consentendo alle cellule di aderire alle singole microfibre.
Rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente l'impalcatura con PBS. Coltivare questa impalcatura in un terreno appropriato fino a formare il tessuto vascolarizzato desiderato. La biostampa microfluidica qui descritta, consente la biostampa diretta di scaffold microfibrosi utilizzando bioink a bassa viscosità.
Un'impalcatura di sei per sei per sei millimetri quadrati< contenente più di 30 microfibre, potrebbe essere biostampata in 10 minuti. Le micrografie delle micrografie dell'impalcatura mostrano l'eccellente integrità strutturale durante il processo di bioprinting. Si ottiene con l'immediata reticolazione ionica del componente alginato con cloruro di calcio.
Dopo l'estrusione microfluidica del bioink, la reticolazione ionica e la fotoreticolazione, gli HUVEC hanno mantenuto una vitalità relativamente elevata. Le cellule proliferavano e migravano dalla distribuzione inizialmente casuale al giorno zero, alle periferie delle microfibre al giorno 16. I cardiomiociti neonatali di ratto che sono stati seminati sull'impalcatura sono maturati e hanno popolato l'impalcatura.
Hanno mostrato una forte espressione di biomarcatori cardiaci funzionali. Come l'alfa actinina sarcomerica e la connessina 43. La microscopia confocale di uno scaffold microfibroso biostampato, popolato da cardiomiociti, ha rivelato la coesistenza sia di HUVEC che di cardiomiociti.
Gli HUVEC sono presenti principalmente nei confini delle microfibre, mentre i cardiomiociti circondano l'esterno delle microfibre. Le cellule sono state in grado di mantenere il loro battito spontaneo e sincronizzato per un massimo di 9-28 giorni. A seconda della fonte cellulare e della configurazione degli scaffold.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre tessuti vascolarizzati utilizzando la tecnica di bioprinting microfluidico, nonché la fabbricazione della testina di stampa e le operazioni di biostampa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fabbricazione della testina di stampa e le operazioni della biostampante possono essere complicate per le persone che non ne hanno mai utilizzata una prima. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di rendere concentrici i due aghi nella testina di stampa e lasciare che il flusso si stabilizzi prima di iniziare il bioprinting.
Con lo sviluppo di questa tecnica, i ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale e della biofabbricazione hanno ora un altro strumento abilitante per generare costrutti di tessuto vascolarizzato per scopi di rigenerazione in vivo o per modellare tessuti in vitro.
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Panoramica
Questo articolo presenta una metodologia di bioprinting microfluidica finalizzata alla generazione di costrutti tissutali vascolarizzati. La tecnica affronta le sfide della biofabbricazione consentendo la creazione di un letto vascolare tridimensionale che può essere popolato con tipi cellulari secondari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biococstruzione
- Microfluidica
- Ingegneria dei tessuti
Sfondo
- La creazione di tessuti vascolarizzati è fondamentale per lo sviluppo degli organoidi.
- I metodi attuali presentano limitazioni nella realizzazione di strutture tessutali complesse.
- La biostampa microfluidica offre un approccio versatile per superare queste sfide.
- Questa tecnica può essere adattata per diversi tipi di tessuti, inclusi tessuti cardiaci, epatici e cutanei.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la creazione di costrutti tessutali vascolarizzati.
- Migliorare la comprensione delle tecniche di biofabbricazione.
- Fornire una base per future applicazioni nell'ingegneria tissutale.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una testina di stampa microfluidica a doppio strato concentrico.
- Utilizzo di un ago ottuso più piccolo come nucleo all'interno di un ago ottuso più grande.
- Seeding di tipi cellulari secondari all'interno della struttura microfibrosa.
- Applicazione del metodo a vari tipi di tessuti oltre ai tessuti cardiaci.
Risultati principali
- Il protocollo genera con successo un costrutto tissutale vascolarizzato.
- Dimostrata versatilità nella creazione di diversi tipi di tessuti.
- Forniti spunti sull'ingegnerizzazione di strutture tissutali complesse.
- Identificate potenziali difficoltà per i principianti nel processo di bioprinting.
Conclusioni
- Il metodo di biostampa microfluidica è efficace per l'ingegneria dei tessuti vascolarizzati.
- Questo approccio può facilitare progressi nella ricerca sugli organoidi.
- Studi futuri potranno ampliarne l'applicazione ad altri tipi di tessuti e condizioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La biostampa microfluidica consente l'ingegnerizzazione di costrutti di tessuti vascolarizzati con elevata fedeltà strutturale, affrontando un collo di bottiglia critico nello sviluppo di modelli preclinici. Generando reti microvascolari perfondibili all'interno di scaffold in idrogel, questo metodo supporta la creazione di modelli di tessuto più fisiologicamente rilevanti per lo screening farmacologico e studi meccanicistici. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, fornendo una piattaforma regolabile per studiare le interazioni tra cellule, la maturazione del tessuto e le risposte funzionali in condizioni controllate.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni tra endotelio-periciti o cellule stromali all'interno di una nicchia vascolare definita, al fine di convalidare bersagli terapeutici coinvolti nell'angiogenesi o nella permeabilità vascolare.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile, controllato microfluidicamente, per generare impalcature vascolarizzate con un'architettura di microfibre e formazione di lume costante.
- Valore predittivo: Permette la valutazione degli effetti di composti sull'integrità vascolare e sulla migrazione cellulare in un microambiente tridimensionale rilevante per l'uomo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera scaffold microfibrillari standardizzati con cellule endoteliali incapsulate che formano strutture simili a lumi, consentendo la valutazione quantitativa della formazione di reti vascolari nel tempo.
- Valore operativo: Compatibile con la biostampa mediante pompa per siringhe a doppio canale, consentendo un controllo preciso del rilascio del bioink e del fluido di reticolazione per la fabbricazione ad alta produttività di scaffold.
- Prontezza per saggi: Produce scaffold con oltre 30 microfibre in un volume di 6x6x6 mm entro 10 minuti, favorendo la preparazione scalabile per la successiva semina di cellule secondarie e lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente il seminagio secondario di cardiomiociti o altre cellule parenchimali nello spazio interstiziale, facilitando lo studio della maturazione del tessuto vascolarizzato e della funzione contrattile sincronizzata.
- Continuità traslazionale: Supporta colture a lungo termine (>16 giorni) con monitoraggio della migrazione cellulare, della formazione di lume e dell'espressione di biomarcatori (ad esempio, alfa-actinina sarcomerica, connexina 43) per modellare risposte a livello tessutale.
- Limitazione del rischio: Permette la valutazione della vitalità cellulare, della proliferazione e della maturazione funzionale in condizioni simili alla perfusione, riducendo il fallimento dovuto a un cattivo innesto vascolare nelle fasi successive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo una piattaforma vascolarizzata che fa da ponte tra monoculture semplici e modelli in vivo complessi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su vie dipendenti dai vasi sanguigni consentendo una co-coltura controllata di cellule endoteliali e parenchimali in una geometria 3D definita.
- Screening: Fornisce impalcature pronte per i saggi con microstruttura ed endotelializzazione riproducibili, adatte per valutare gli effetti di composti sulla stabilità vascolare e sull'organizzazione del tessuto.
- Analisi: Permette letture quantitative mediante microscopia confocale della distribuzione cellulare, della formazione di lumi e della co-localizzazione di biomarcatori per valutare la qualità del tessuto e la maturazione funzionale.
- Ricerca traslazionale: Modella lo sviluppo del tessuto vascolarizzato, dalla formazione iniziale della rete endoteliale all'integrazione delle cellule secondarie, supportando la validazione preclinica di candidati mirati ai vasi sanguigni o di tipo rigenerativo.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione della testina microfluidica e il sistema di bioinchiostro (GelMA-alginato con reticolazione ionica e fotoindotta) rappresentano una piattaforma riutilizzabile adattabile a diversi tipi di tessuto (cardiaco, epatico, cutaneo) e a diversi tipi di cellule secondarie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva generando tessuti vascolarizzati con strutture simili a lume perfondibili e funzione cellulare sostenuta (ad esempio, battito sincronizzato fino a 28 giorni).
- Valore operativo: Permette la standardizzazione della fabbricazione del scaffold attraverso il controllo del flusso microfluidico, riducendo la variabilità nel diametro delle microfibre, nell'efficienza del reticolaggio e nella distribuzione cellulare.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione fornendo informazioni precoci sulla compatibilità vascolare e sulle risposte a livello tessutale, riducendo i fallimenti tardivi dovuti a una vascolarizzazione inadeguata.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio dei candidati in base ai loro effetti in un modello di tessuto vascolarizzato rilevante per l'uomo, che riproduce i principali elementi strutturali e funzionali distintivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, inclusa l'assemblaggio di aghi concentrici e la sigillatura con resina epossidica per prevenire perdite.
- È dipendente da sistemi di pompe per siringhe a doppio canale e da attrezzature per la fotopolimerizzazione UV per una somministrazione precisa del bioink e la stabilizzazione del GelMA.
- Necessita di un'ottimizzazione della concentrazione cellulare (5–10×10⁶ HUVECs/mL) e delle portate (5 µL/min) per garantire la vitalità cellulare e un'incapsulazione uniforme durante la stampa.
- Richiede manipolazione asettica e l'uso di carta filtro sterile per la rimozione del mezzo durante la semina secondaria delle cellule, al fine di evitare contaminazioni e assicurare un'adeguata infiltrazione.
- È limitato dalla necessità di un risciacquo post-stampa per rimuovere l'eccesso di cloruro di calcio, il che aggiunge un passaggio manuale che deve essere standardizzato tra i diversi lotti.
