PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni
18 luglio 2017
Qui descriviamo un metodo innovativo per determinare i polimorfismi di lunghezza del recettore del recettore 1 (CR1) per l'uso in diverse applicazioni, in particolare la valutazione della suscettibilità a malattie come la malattia di Alzheimer (AD). Questo metodo potrebbe essere utile per comprendere meglio il ruolo delle isoforme CR1 nella patogenesi dell'AD.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di genotipizzare i polimorfismi di lunghezza del recettore 1 del complemento da utilizzare nella valutazione della suscettibilità a malattie, come il morbo di Alzheimer, per comprendere meglio il ruolo delle isoforme di CR1 nella patogenesi della malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come la patogenesi del morbo di Alzheimer. I principali vantaggi di questa tecnica è che non richiede campioni di sangue fresco ed è più facile, più economica, più veloce e quindi applicabile a popolazioni più grandi.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo riconosciuto le sfide nell'esecuzione dei Western blot per quanto riguarda il tempo necessario e la necessità di campioni di sangue fresco. Pipettare 20 microlitri di proteinasi K sul fondo di una provetta da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di campione alla provetta.
Aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi al campione. Mescolare a impulsi per 15 secondi. Dopo la miscelazione, incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti a bagnomaria.
Centrifugare brevemente la provetta da 1,5 millilitri per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio. Quindi, aggiungere 100 microlitri di etanolo al campione. Mescolare nuovamente a impulsi per 15 secondi prima di centrifugare brevemente la provetta come prima.
Successivamente, applicare con cura la miscela sulla colonna della membrana in una provetta di raccolta da due millilitri. Senza bagnare il bordo, chiudere il tappo e centrifugare a 6.000 volte G per un minuto. Posizionare la colonna a membrana in una provetta di raccolta pulita da due millilitri e gettare la provetta contenente il filtrato.
Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 6,000 volte G per un minuto. Quindi, posizionare la colonna a membrana in una provetta di raccolta pulita da due millilitri e gettare la provetta contenente il filtrato.
Dopo aver aperto con cura la colonna a membrana, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio due senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 20.000 volte G per tre minuti. Quindi, posizionare la colonna a membrana in una nuova provetta di raccolta da due millilitri e centrifugare nuovamente.
Dopo la centrifugazione, posizionare la colonna a membrana in una provetta pulita da 1,5 millilitri e gettare la provetta di raccolta contenente il filtrato. Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 200 microlitri di acqua distillata. Incubare la colonna a temperatura ambiente per cinque minuti prima di centrifugare a 6.000 volte G per un minuto.
Per eseguire il protocollo HRM-PCR, diluire prima i campioni di DNA in provette da 1,5 millilitri con acqua a una concentrazione di 10 nanogrammi per microlitro. Successivamente, diluire le soluzioni di primer scongelate in provette da 1,5 millilitri con acqua alla stessa concentrazione di sei micromolari. Scongelare le soluzioni del kit HRM-PCR e miscelare accuratamente a vortice per garantire il recupero di tutto il contenuto.
Centrifugare brevemente le tre fiale contenenti la miscela enzimatica con il colorante legante il DNA, il cloruro di magnesio e l'acqua in una microcentrifuga prima di aprirle. In una provetta da 1,5 millilitri a temperatura ambiente, utilizzare i componenti per preparare la miscela PCR per la reazione da 120 microlitri come descritto nel protocollo di testo. Mescolare accuratamente a vortice.
È fondamentale lavorare con attenzione e applicazione secondo le buone pratiche in biologia molecolare. Pipettare 19 microlitri della miscela PCR in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto bianca. Aggiungere un microlitro del modello di DNA aggiustato per la concentrazione, quindi sigillare la piastra multipozzetto bianca con un foglio sigillante.
Centrifugare la piastra bianca a più pozzetti per un minuto a 1,500 volte G in una centrifuga standard a secchio oscillante contenente un rotore per piastre a più pozzetti con adattatori adatti. Caricare la piastra multipozzetto bianca nello strumento HRM-PCR. Avviare il programma HRM-PCR con le condizioni PCR presenti nel protocollo di testo.
Dopo la reazione HRM-PCR, eseguire l'analisi HRM per determinare il polimorfismo di lunghezza CR1 come descritto nel protocollo di testo. Le curve di fusione sono state analizzate utilizzando il software dopo la fusione ad alta risoluzione degli ampliconi derivati dalla PCR dal DNA genomico di soggetti con diverse isoforme di CR1. I risultati sono curve che discriminano i soggetti in base ai loro fenotipi allotipici di espressione di CR1.
Come mostrato dalle due modalità di presentazione, dalle curve di fusione normalizzate e spostate e dal grafico delle differenze normalizzate e variate in temperatura, i profili delle curve sono distribuiti secondo la stella CR1 tre, la stella CR1 un gruppo, la stella CR1 uno, la stella CR1 due gruppi, la stella CR1 un gruppo, la stella CR1 due gruppi e la stella CR1 due, CR1 stella quattro gruppo. Queste curve corrispondono agli alleli del polimorfismo di lunghezza CR1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come genotipizzare facilmente il polimorfismo di lunghezza CR1 secondo curve perfette ottenute mediante HRM-PCR.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della necessità di campioni di riferimento di genotipi di lunghezza CR1 già noti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la stessa concentrazione per ogni campione di DNA.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento conico del DNA per rispondere a ulteriori domande come la scoperta di un nuovo SNP privato noto. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada alla ricerca nel campo della genetica delle popolazioni per esplorare la pressione selettiva dei patogeni nel polimorfismo di lunghezza CR1. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla suscettibilità nella patogenesi della malattia di Alzheimer, può anche essere applicato ad altri studi su malattie come il lupus eritematoso sistemico e la malaria.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per il genotipaggio delle polimorfie di lunghezza del recettore del complemento 1 (CR1), che può contribuire alla valutazione della suscettibilità a malattie come la malattia di Alzheimer (AD). La tecnica presenta il vantaggio di non richiedere campioni di sangue fresco ed è più efficiente per popolazioni di grandi dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Patologia
Sfondo
- Si ritiene che gli isoformi di CR1 siano coinvolti nella patogenesi della malattia di Alzheimer.
- Comprendere i polimorfismi di lunghezza di CR1 può fornire informazioni sul rischio di malattia.
- I metodi tradizionali come i blotting Western presentano limitazioni, tra cui la necessità di campioni freschi.
- Questo metodo mira a superare tali ostacoli.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per il genotipaggio delle polimorfie di lunghezza di CR1.
- Valutare la relazione tra gli isoformi di CR1 e la suscettibilità alla malattia di Alzheimer.
- Facilitare la ricerca in genetica di popolazione riguardo alle polimorfie di CR1.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del campione mediante proteinasi K e buffer di lisi.
- PCR con fusione ad alta risoluzione (HRM-PCR) per il genotipaggio.
- Analisi delle curve di fusione per discriminare i fenotipi di espressione di CR1.
- Applicazione del metodo a vari studi su malattie oltre l'Alzheimer.
Risultati principali
- Il metodo consente un genotipaggio efficiente dei polimorfismi di lunghezza di CR1.
- I risultati mostrano profili distinti di curve di denaturazione corrispondenti a diversi alleli di CR1.
- Applicabilità dimostrata su popolazioni più ampie senza l'uso di campioni freschi.
- Potenzialità per ulteriori ricerche su altre malattie come il lupus eritematoso sistemico e la malaria.
Conclusioni
- Questo metodo innovativo migliora la comprensione del ruolo di CR1 nella malattia.
- Fornisce un approccio pratico per studi genetici su larga scala.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diverse malattie influenzate da polimorfismi di CR1.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La genotipizzazione dei polimorfismi di lunghezza del recettore del complemento 1 (CR1) consente una riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli per la malattia di Alzheimer, collegando l'espressione degli isoformi ai percorsi di eliminazione dell'amiloide-beta. Questo metodo PCR ad alta risoluzione di fusione fornisce un'elevata affidabilità predittiva per l'analisi delle ipotesi terapeutiche, senza richiedere campioni freschi, supportando screening su larga scala negli studi di genetica delle popolazioni. L'approccio migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla valutazione preclinica della suscettibilità alla malattia mediata da CR1.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche correlando il polimorfismo di lunghezza di CR1 con la capacità di fagocitosi dell'amiloide-beta.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico per bersagli mediati dal complemento mediante l'utilizzo di DNA archiviato, riducendo la dipendenza da campioni biologici freschi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale quantificando la distribuzione degli isoformi associata a una regolazione alterata del complemento nei percorsi neurodegenerativi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Produce rapporti quantitativi delle curve HRM che discriminano gli allotipi CR1 per un genotipaggio affidabile in grandi coorti.
- Valore operativo: Standardizza il rilevamento degli ampliconi attraverso il confronto tra frammenti invarianti e varianti, garantendo riproducibilità tra laboratori.
- Scalabilità: Applicabile a studi su scala di popolazione grazie al basso costo, ai minimi requisiti di input e alla compatibilità con piattaforme PCR ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega il genotipaggio degli isoformi di CR1 ai meccanismi fisiopatologici nella malattia di Alzheimer e in altre condizioni immuno-mediate.
- Continuità preclinica: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio, stratificando i modelli in base ai profili di polimorfismo della lunghezza di CR1.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce il potenziale di interazione con il bersaglio identificando soggetti con una clearance alterata, mediata da CR1, di peptidi patogeni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo coorti geneticamente definite per lo screening meccanicistico e l'allineamento dei biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo del CR1 nella rimozione dei complessi immunitari e nei percorsi di neuroinfiammazione.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per la valutazione dell'effetto di composti in campioni stratificati per CR1.
- Analisi: Genera misurazioni di rapporto derivate dalla HRM che consentono il confronto statistico delle associazioni genotipo-fenotipo.
- Ricerca traslazionale: Collega la stratificazione genetica alla validazione preclinica di terapie mirate al sistema del complemento solo quando supportato dai dati disponibili.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di genotipizzazione riutilizzabile, applicabile a diverse aree di malattie oltre l'Alzheimer, inclusi disturbi infettivi e autoimmuni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione del bersaglio grazie al collegamento meccanicistico tra isoforme di CR1 e patogenesi della malattia.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità rese possibili dalla PCR-HRM in provetta chiusa e da un minimo trattamento del campione.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo grazie alla riduzione dell'incertezza biologica riguardo al legame al bersaglio e alla modulazione del percorso.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio dei candidati modulatori del complemento sulla base di profili di suscettibilità geneticamente definiti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ottimizzazione della PCR e nell'analisi ad alta risoluzione delle curve di denaturazione.
- Dependenza dall'accesso a strumentazione compatibile con l'HRM e a genotipi di riferimento validati per un'accurata assegnazione degli alleli.
- Necessità di standardizzare tra gruppi di lavoro le procedure di quantificazione del DNA e di diluizione dei primer per garantire coerenza tra laboratori.
- Aspetti da considerare nell'adattamento includono la validazione su diversi tipi di campioni (ad esempio, sangue, saliva) mantenendo rapporti costanti degli ampliconi.
- Limitazione pratica: l'accuratezza del metodo dipende dalla disponibilità di campioni di riferimento con genotipi noti per la lunghezza del CR1, necessari per l'interpretazione delle curve.
