Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment

L'obiettivo generale di questo metodo è fornire una procedura semplice ed efficace di colorazione negativa in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per campioni virali all'interno di ambienti a contenimento biologico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in virologia riguardo alla morfologia e alle strutture dei virus in esame. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nella facilità e nell'efficacia con cui è possibile manipolare le griglie per microscopia elettronica all'interno di ambienti a contenimento biologico. Questa tecnica risulta utile nell'ambito della diagnosi TEM di un virus sconosciuto poiché può essere facilmente applicata a campioni virali in ogni tipo di ambiente. Sebbene abbiamo utilizzato principalmente questo metodo per supportare studi TEM sui virus, esso ha applicazioni molto più ampie ed è impiegabile nell'indagine al microscopio elettronico della maggior parte delle nanoparticelle. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché è necessario un certo livello di pratica per garantire che le griglie TEM non vengano danneggiate durante il caricamento e lo scaricamento dalle capsule.

L'idea per questo metodo è nata quando avevamo problemi nel manipolare piccole griglie per microscopia elettronica in condizioni di contenimento biologico.

Per iniziare questa procedura, preparare o acquistare griglie di rame per microscopia elettronica a trasmissione (TEM) rivestite con Formvar e carbonio. Inserire le griglie rivestite nelle capsule. Successivamente, trasferire le capsule caricate insieme ad altri materiali e reagenti all'interno del contenimento biologico. Per iniziare, fissare la capsula a una pipetta. Aspirare 40 microlitri di sospensione virale all'interno della capsula. Posizionare la pipetta di lato, con le griglie orientate orizzontalmente per 10 minuti. Successivamente, prendere la pipetta ed espellere la soluzione virale in un contenitore per rifiuti. Aspirare 40 microlitri di fissativo al 2% di glutaraldeide nelle capsule. Posizionare la pipetta di lato per 20 minuti. Dopo questo tempo, espellere il fissativo e aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula, per rimuovere il fissativo. Ripetere questo lavaggio per tre volte.

Successivamente, aspirare 40 microlitri di acetato di uranile allo 0,1% o di acido fosfotungstico di potassio all'1% nella capsula. Lasciare la capsula in posa per 30 secondi. Poi, rimuovere la capsula dalla pipetta.

Toccare un pezzo di carta da filtro sul bordo delle griglie per asciugarle. Trasferire la carta da filtro in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Successivamente, immergere la carta da filtro in una soluzione al 1% di tetrossido di osmio.

Posizionare la capsula con il coperchio aperto all'interno del tubo. Sigillare il tubo per un'ora per consentire la completa permeazione del vapore di tetrossido di osmio. Successivamente, decontaminare il tubo e trasferirlo dalla biocontenimento al laboratorio di microscopia elettronica di livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2).

Rimuovere la capsula dal tubo della centrifuga, quindi posizionarla su una pipetta. Aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula e quindi dispensare l'acqua in un contenitore per rifiuti. Ripetere questo lavaggio con acqua per tre volte.

Successivamente, rimuovere la capsula dalla pipetta. Utilizzando carta da filtro, asciugare i griglie. Lasciare asciugare i griglie all'aria e quindi conservarli in una scatola per griglie fino al momento dell'esecuzione dell'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Per iniziare, mescolare la sospensione virale con un volume uguale di glutaraldeide al 4%, ottenendo una concentrazione finale di glutaraldeide al 2%. Utilizzando il fissativo, inattivare il virus per almeno 24 ore. Decontaminare il tubo e trasferirlo nella struttura EM di livello di biosicurezza 2 (BLS-2). Successivamente, fissare una griglia con il campione su una pipetta. Aspirare la miscela nella capsula. Posizionare la pipetta di lato con le griglie orientate orizzontalmente per 10 minuti.

Successivamente, prendere la pipetta ed espellere la miscela virale in un contenitore per rifiuti. Aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula, quindi smaltire l'acqua in un contenitore per rifiuti. Ripetere questo lavaggio per tre volte.

Successivamente, aspirare 40 microlitri di UA allo 1% o di PTA allo 1% nella capsula per 30 secondi. Rimuovere la capsula dalla pipetta. Utilizzando carta filtro, asciugare tamponando le griglie.

Quindi, lasciare asciugare le griglie all'aria.

In questo studio, campioni del virus Ebola di Zaire sono sottoposti a colorazione negativa, utilizzando sia il metodo manuale a goccia sia il metodo a capsula. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) ottenute con questi metodi mostrano entrambe dettagli ben definiti, con strutture del nucleocapside al centro della particella virale e glicoproteine visibili sulla superficie. Pertanto, il metodo a capsula è in grado di produrre immagini TEM di qualità simile a quelle ottenute con il metodo manuale a goccia. Successivamente, vengono confrontati diversi metodi di inattivazione del campione utilizzando il virus Chikungunya. L'inattivazione del campione viene ottenuta rapidamente, mediante l'uso di glutaraldeide al 2% per 20 minuti e successiva esposizione a tetrossido di osmio all'1% per un'ora, oppure in modo prolungato durante la notte, utilizzando glutaraldeide al 2% per 24 ore. Come si può osservare, il processo di inattivazione più lungo, senza tetrossido di osmio, consente di visualizzare un maggior dettaglio ultrastrutturale.

Successivamente, utilizzando il metodo della capsula, sono stati confrontati due coloranti mediante particelle simili a virus fissate con aldeide. Sia l'acetato di uranile che l'acido fosfotungstico mostrano risultati di alta qualità, con bordi ben definiti e glicoproteine visibili.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza, a seconda del numero di campioni. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di scegliere il fissativo e i reagenti di colorazione appropriati in base agli obiettivi sperimentali. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come il conteggio delle particelle possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande calcolando le concentrazioni virali.

Questa tecnica migliora il modo in cui i virologi possono esplorare con maggiore facilità le informazioni sulla morfologia e sulla struttura dei virus, in particolare nei virus di livello BLS-3 e 4. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare facilmente le griglie per microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per la colorazione negativa all'interno di sistemi di biocontenimento. Non dimenticare che lavorare con aldeide, tetrossido di osmio e acetato di uranile può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di idonei dispositivi di protezione individuale e di una cappa chimica durante l'esecuzione di questa procedura.