Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico
6 novembre 2017
Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare la cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla regolazione genica e sulle fibre muscolari scheletriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la preparazione della cromatina di grado ChIP dal muscolo scheletrico del topo.
Un tessuto fisicamente resistente con un alto contenuto di proteine strutturali. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di caratterizzare i meccanismi molecolari alla base dell'atrofia muscolare dell'uso del glucosio-articolato, che richiede l'identificazione del recettore del glucosio-articolato, dei siti di legame del DNA nelle fibre muscolari scheletriche del topo. A dimostrare la procedura sarà Shilpy Joshi, un post-doc del nostro laboratorio.
Per iniziare questa procedura, recuperare i muscoli degli arti posteriori congelati o appena sezionati. Successivamente, tritare i muscoli in una provetta da due millilitri, contenente un millilitro di tampone ipotonico ghiacciato fino a una preparazione omogenea di piccoli pezzi, utilizzando delle forbici sottili. Successivamente, lasciare agitare il tubo su un agitatore da banco a quattro gradi Celsius per cinque-10 minuti.
Successivamente, trasferire il tessuto sezionato in una provetta a fondo tondo da 14 millilitri contenente quattro millilitri di tampone ipotonico freddo. Omogeneizzare il tessuto tritato, utilizzando un omogeneizzatore meccanico di tessuti per 15-30 secondi. Successivamente, trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 millilitri.
Aggiungere un tampone ipotonico freddo per ottenere 10 millilitri di campione e fissare l'omogeneizzato prima di procedere con il topo successivo. In questa procedura, aggiungere formaldeide al campione per ottenere una concentrazione finale dell'1%. E poi agitare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 molari in ciascun tubo per interrompere la fissazione. E agitare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, omogeneizzare il lisato fisso, usando un batuffolo sciolto.
Quindi, trasferirlo in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere nuclei e detriti cellulari. Dopo cinque minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone ipotonico fresco. Filtrare il lisato attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in una provetta da 50 millilitri.
Utilizzando la punta di una pipetta, lavare il filtro con un millilitro di tampone ipotonico freddo. Successivamente, rifiltrare il filtrato attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Successivamente, trasferire il filtrato in una provetta da 15 millilitri.
E centrifugare a 1000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere il pellet nucleare. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare un millilitro di tampone ipotonico per raccogliere i tre pellet e trasferirli in un tubo da 1,5 a due millilitri. Centrifugare a 1000 g per cinque minuti.
Successivamente, valutare il volume del pellet nucleare confrontandolo con tubi contenenti un volume noto di liquido e risospenderlo in un tampone di sonicazione fino a tre o quattro volte il volume nucleare impaccato. Successivamente, sonicare la sospensione per 10-15 minuti a quattro gradi Celsius, utilizzando un sonicatore. Centrifugare il campione sonicato e trasferire il surnatante della cromatina in una provetta fresca da 1,5 millilitri.
Per dereticolare, prendere 30 microlitri di cromatina in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 20 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 450 microlitri di acqua. Completare il volume a 500 microlitri e incubare a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, eseguire un trattamento con un microlitro di proteinasi K, 10 microlitri di tris a due molari a pH 6,8 e 10 microlitri di EDTA molare 0,5 per un'ora a 42 gradi Celsius.
Quindi, eseguire una regolare estrazione fenolo-cloroformio cloroformio e precipitare il DNA con un volume di acetato di sodio e due volumi di etanolo al 100% per un'ora a meno 80 gradi Celsius o durante la notte a -20 gradi Celsius. Quindi, pellettare il DNA mediante centrifugazione a 13, 500 g per 15 minuti. Decantare il surnatante e lavare accuratamente il pellet con etanolo freddo al 70% e centrifugare nuovamente per cinque minuti.
Quindi decantare il surnatante e asciugare il pellet all'aria. Successivamente, risospendere il pellet nel volume originale del tampone tris HCl EDTA. Misurare la concentrazione di DNA in uno spettrofotometro mediante assorbenti a 260 nanometri, 280 nanometri.
Successivamente, pipettare da 500 a 1000 nanogrammi di DNA insieme a una scala delle dimensioni di DNA su corsie separate di un gel di agarosio all'1,5%. Ed eseguire l'elettroforesi per valutare la dimensione del frammento della cromatina. Per ottimizzare, l'omogeneizzazione è stata eseguita per 15 secondi o 45 secondi a due velocità, 18.000 e 22.000 giri/min.
In tutte le condizioni, i nuclei potevano essere separati dai detriti di tessuto, ma la resa era ottimale utilizzando una velocità inferiore. I nuclei potevano anche essere preparati doungendoli per tre o cinque minuti. Ma l'omogeneizzazione meccanica è il metodo di scelta in quanto le rese ottimali dei nuclei possono essere raggiunte in soli 15 secondi, consentendo un notevole guadagno di tempo, soprattutto se è necessario elaborare più campioni.
Utilizzando questo protocollo, è possibile isolare fino a 2,7 volte 10 su sette nuclei da 500 milligrammi di tessuto per generare 100 microgrammi di cromatina. La cromatina preparata in questo modo fornisce risultati puliti e di alta qualità negli esperimenti di sequenziamento ChIP. Come illustrato dagli alti livelli di K27 acetilato dell'istone H3 e della RNA polimerasi 2 nel locus di Desmond espresso dal muscolo.
La specificità per la fibra muscolare è dimostrata da un segnale basso o assente nei loci Pecam1 e Vcam1 che non sono espressi nel muscolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante immergere correttamente la sonda dell'omogeneizzatore nel campione per evitare la formazione di schiuma, pulire la sonda tra i campioni e ottimizzare la frammentazione della cromatina. La cromatina preparata in questo modo è stata utilizzata con successo per ChIP per mappare l'occupazione del fattore di trascrizione dell'intero genoma e dovrebbe anche essere adatta per le tecniche di cattura della conferma della cromatina.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo della genomica, per esplorare la regolazione genica nel muscolo scheletrico dei topi. La procedura può essere applicata anche al muscolo del ratto e alle biopsie di pazienti umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'omogeneizzazione meccanica, seguita dalla purificazione dei nuclei fissati con formaldeide per preparare la cromatina dal muscolo scheletrico per l'immunoprecipitazione.
Non dimenticare che lavorare con formaldeide, fenolo, cloroformio e proteinasi K può essere pericoloso. Devono essere prese precauzioni come indossare guanti e occhiali. Le fasi che coinvolgono questi reagenti devono essere eseguite sotto una cappa.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina da muscolo scheletrico di topo adulto, specificamente adattato per lo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il metodo affronta le difficoltà legate alla resistenza fisica e al contenuto di proteine strutturali del tessuto muscolare scheletrico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Regolazione genica
- Immunoprecipitazione della cromatina
- Biologia del muscolo scheletrico
Sfondo
- La preparazione della cromatina è fondamentale per lo studio della regolazione genica.
- Il muscolo scheletrico del topo è un tessuto complesso con un elevato contenuto di proteine strutturali.
- Comprendere i meccanismi molecolari dell'atrofia muscolare è essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- L'identificazione dei siti di legame al DNA è necessaria per caratterizzare la regolazione genica.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la preparazione di cromatina di qualità adatta per ChIP da muscolo scheletrico di topo.
- Facilitare lo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari.
- Indagare i meccanismi molecolari alla base dell'atrofia muscolare.
Metodi Utilizzati
- Preparazione della cromatina da muscolo scheletrico di topo adulto.
- Applicazione di tecniche di immunoprecipitazione della cromatina.
- Caratterizzazione di recettori glucocorticoidi e siti di legame al DNA.
- Dimostrazione della procedura da parte di un ricercatore post-dottorato.
Risultati principali
- Preparazione efficace di cromatina di qualità adatta per ChIP da tessuto muscolare scheletrico resistente.
- Identificazione di siti chiave di legame al DNA rilevanti per la regolazione genica muscolare.
- Informazioni sui meccanismi molecolari dell'atrofia muscolare.
- Convalida dell'efficacia del metodo per ricerche future.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora lo studio della regolazione genica nel muscolo scheletrico.
- Fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia muscolare.
- Applicazioni future potrebbero portare a una migliore comprensione dell'atrofia muscolare e delle condizioni correlate.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione di cromatina di alta qualità da tessuti fisicamente resistenti come il muscolo scheletrico rappresenta ancora un collo di bottiglia nella validazione di bersagli epigenetici. Questo protocollo consente l'isolamento riproducibile di nuclei e la sonificazione di cromatina adatta all'immunoprecipitazione, supportando la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli dei fattori di trascrizione e dei modificatori istonici nei modelli di malattie correlate al muscolo. Fornendo un approccio scalabile e standardizzato per la preparazione di cromatina di qualità adatta al ChIP, esso aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro di scoperta precoce incentrati sulla patofisiologia del muscolo scheletrico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi della regolazione trascrizionale nelle fibre muscolari scheletriche per convalidare bersagli coinvolti nei percorsi di atrofia e metabolici.
- Valore operativo: Fornisce rese costanti di cromatina da tessuti resistenti, riducendo la variabilità nei saggi di occupazione del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cromatina pronta per ChIP per lo screening ad alto rendimento di composti che influenzano i regolatori epigenetici nel muscolo.
- Valore operativo: I passaggi standardizzati di purificazione dei nuclei e sonica supportano la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita l'allineamento dei biomarcatori mappando le modifiche istoniche e l'occupazione dei fattori di trascrizione in modelli muscolari rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Consente l'analisi longitudinale della cromatina da tessuto congelato, sostenendo la continuità preclinica e la validazione degli obiettivi attraverso diverse fasi dello studio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta consentendo la preparazione della cromatina per la validazione dell'obiettivo, seguita da immunoprecipitazione e sequenziamento per guidare l'identificazione dei composti promettenti e la valutazione preclinica di modulatori epigenetici nel muscolo scheletrico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di regolazione genica nei modelli di atrofia muscolare e di malattie metaboliche.
- Screening: Fornisce un substrato cromatinico standardizzato per valutare gli effetti di composti su bersagli epigenetici.
- Analisi: Genera letture quantitative di ChIP-seq per confrontare il legame al bersaglio in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte epigenetiche della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso una preparazione cromatinica costante.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di isolamento di nuclei e preparazione del cromatina per programmi di epigenetica del muscolo scheletrico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore Scientifico: Migliora la fiducia nella validazione degli obiettivi riducendo il rumore derivante dalla cromatina di cellule non muscolari nei campioni di muscolo scheletrico.
- Valore Operativo: Aumenta la produttività grazie all'omogeneizzazione meccanica rapida, consentendo l'elaborazione di più campioni in brevi periodi di tempo.
- Valore Strategico: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di obiettivi epigenetici fornendo dati affidabili sulla cromatina specifica del tessuto muscolare.
- Impatto sul Portafoglio: Permette la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio, basandosi su profili epigenetici riproducibili in tessuti rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella omogeneizzazione dei tessuti, nell'isolamento dei nuclei e nella manipolazione della cromatina per evitare il degrado.
- Richiede l'accesso a un apparecchio per la sonificazione ottimizzato per la frammentazione della cromatina senza surriscaldamento.
- Necessita di condizioni standardizzate di tampone e di passaggi di filtrazione per garantire la riproducibilità tra diversi utilizzatori e sedi.
- È necessario tenere conto di variabili specifiche del tessuto, come il tipo di fibra e lo stato di lesione, quando si applica il protocollo a modelli di malattia.
- I limiti pratici includono la necessità di un'attenta ottimizzazione del tempo e della temperatura di sonificazione per ottenere una dimensione ottimale dei frammenti.
