Ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici con un nanorivestimento StarPEG eparinizzata
23 giugno 2018
Questo protocollo si propone di raggiungere ingegneria delle superfici degli isolotti pancreatici utilizzando un nanorivestimento starPEG eparina-incorporato tramite pseudo-bioorthogonal chimica tra i gruppi di N- Idrossisuccinimide del DFI e i gruppi amminici di isolotto della membrana cellulare.
Questo metodo può aiutare a risolvere le principali sfide nel trapianto di isole pancreatiche, come l'immunorigetto, la rivascolarizzazione post-trapianto e la sopravvivenza. I principali vantaggi di questa tecnica è che questo approccio facile da adottare consente l'ingegneria di superficie delle cellule viventi rimodellando il paesaggio cellulare delle isole pancreatiche, migliorando la funzione dell'innesto, la sopravvivenza e, in ultima analisi, l'efficacia terapeutica del trapianto di isole. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari perché l'esito terapeutico delle terapie cellulari è limitato anche dalla bassa ritenzione cellulare e dalla scarsa sopravvivenza.
A dimostrare questa procedura è Jingyi Yang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prima cosa, pesare 6,9 grammi di eparina e scioglierla in 2 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo Eppendorf. Sciogliere 0,23 grammi di NHS in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in una provetta Eppendorf.
Quindi, sciogliere 0,77 grammi di EDC in 0,5 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata in un tubo conico da 50 millilitri. Miscelare le soluzioni NHS ed EDC in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver lasciato la soluzione miscelata a temperatura ambiente per 30 minuti, centrifugarla a 12.000 giri/min per 10 minuti per rimuovere l'EDC e l'NHS in eccesso.
Successivamente, aggiungere 30 millilitri di etanolo freddo alla soluzione e centrifugare a 12.000 giri/min per 10 minuti. Ora, aggiungi 1 millilitro di coadiuvante starPEG MI al 10% a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere 0,67 millilitri di soluzione di eparina NHS al 10% allo stesso tubo conico da 50 millilitri.
Mettere la soluzione miscelata in un incubatore a 25 gradi Celsius per 20 minuti per ottenere una soluzione viscosa e limpida. Prelevare 200 isole di topo precedentemente estratte al microscopio da dissezione e trasferirle in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di PBS alle isole e centrifugare a 1.200 giri/min per un minuto a quattro gradi centigradi.
Rimuovere il surnatante, aggiungere 250 microlitri della soluzione di eparina PEG e mettere il composto sul ghiaccio per 10 minuti. Pipettare su e giù per consentire alle isole di mescolarsi bene con la soluzione di eparina PEG. Successivamente, centrifugare la miscela a 1, 200 giri/min per un minuto.
Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di PBS. Pipettare su e giù per mescolare bene. Dopo aver centrifugato a 1, 200 giri/min per un minuto, rimuovere il surnatante e conservare le isole per un ulteriore utilizzo.
Successivamente, aggiungere uno o due millilitri di RPM I 1640, integrato con il 10% di FBS alle isole rivestite. E trasferisci queste isole in una piastra di coltura batterica sterile non carica. Infine, osservare la morfologia e i segnali fluorescenti delle isole rivestite di FAM-eparina-PEG al microscopio a fluorescenza invertita.
Picchi caratteristici di eparina, corrispondenti ai gruppi HYDROXAL, sono stati osservati nello spettro FTIR del nanorivestimento eparina-PEG. La diminuzione dell'ampiezza di questi picchi rappresenta la coniugazione tra i gruppi ammidici coadiuvanti stella-PEG MI e il gruppo carbonico eparina. Anche il picco corrispondente alla vibrazione di stiramento ammidico carbonale è stato ridotto, indicando una reazione sufficiente tra i gruppi carbossilato di eparina con il sucinimiato succinimiale e l'ammina coadiuvante star-PEG.
La scansione di dati al microscopio elettronico mostra la struttura porosa altamente interconnessa del nanorivestimento eparina-PEG, suggerendo che potrebbe essere adatto per la sopravvivenza cellulare durante la somministrazione in vivo. Un sottile strato di nanorivestimento, mostrato dalla fluorescenza verde, è stato depositato uniformemente sulla superficie delle isole rivestite, senza causare cambiamenti evidenti sul volume o sulle dimensioni delle isole. Le isole di topo rivestite di eparina PEG hanno mostrato una robusta vitalità delle isole in coltura.
Una formazione vascolare significativamente più avanzata era evidente dalle cellule endoteliali delle isole che sono state co-coltivate con isole rivestite di eparina-PEG, indicate da strutture allungate simili a microvasi e strutture vascolari a rete. Un basso livello di secrezione di insulina è stato osservato in tutti i gruppi di trattamento quando le isole sono state perfuse con una soluzione salina fisiologica, integrata con un livello substimolante di glucosio. Quando le isole sono state stimolate con un livello superfisiologico di glucosio, è stato osservato un aumento della secrezione di insulina.
Una volta padroneggiato, il rivestimento può essere eseguito in un minuto se viene eseguito correttamente per preservare la vitalità dell'isola.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per l'ingegnerizzazione della superficie delle isole pancreatiche mediante un nanorivestimento a base di starPEG contenente eparina. Questa tecnica mira a migliorare i risultati del trapianto di isole potenziando la funzionalità e la sopravvivenza dell'innesto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Terapie basate su cellule
- Biologia del trapianto
- Ingegneria delle superfici
Sfondo
- Il trapianto di isolotti pancreatici affronta sfide come il rigetto immunitario e la scarsa sopravvivenza degli isolotti.
- Migliorare il paesaggio cellulare degli isolotti può aumentare l'efficacia terapeutica.
- Il nanorivestimento con eparina-PEG offre una possibile soluzione a queste sfide.
- Questo metodo è facile da adottare e può essere eseguito rapidamente.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica di rivestimento che migliori la sopravvivenza e la funzionalità delle isole pancreatiche.
- Affrontare i problemi legati alla bassa ritenzione cellulare nelle terapie basate su cellule.
- Dimostrare l'efficacia del nanorivestimento di eparina-PEG nel migliorare gli esiti del trapianto di isole.
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle soluzioni di eparina e NHS.
- Miscelazione delle soluzioni di NHS e EDC per il nanorivestimento.
- Rivestimento delle isole di topo con la soluzione eparina-PEG.
- Osservazione della morfologia e vitalità delle isole al microscopio a fluorescenza.
Risultati principali
- Gli isolotti rivestiti con eparina-PEG hanno mostrato una viabilità migliorata in coltura.
- È stata osservata una formazione vascolare potenziata nelle cellule endoteliali degli isolotti coltivate in co-coltura.
- La secrezione di insulina era responsiva alla stimolazione con glucosio negli isolotti rivestiti.
- Il rivestimento non ha alterato significativamente il volume o le dimensioni degli isolotti.
Conclusioni
- Il nanorivestimento eparina-PEG è un metodo promettente per migliorare il trapianto di isole.
- Questa tecnica potrebbe aumentare l'efficacia delle terapie basate su cellule.
- Applicazioni future potrebbero estendersi ad altri tipi cellulari che richiedono ingegnerizzazione della superficie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La progettazione superficiale degli isolotti pancreatici mediante un nanorivestimento di starPEG eparinizzato affronta barriere critiche nelle terapie basate su cellule, inclusi il rigetto immunitario e la scarsa sopravvivenza dell'innesto. Questa piattaforma consente la modifica funzionale delle superfici cellulari vive, favorendo esiti migliorati nei trapianti e una continuità traslazionale. L'approccio offre una soluzione scalabile, delicata e adattabile per potenziare la vitalità cellulare e l'efficacia terapeutica nella ricerca e sviluppo preclinica e in fase di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di strategie immunomodulanti per bersagli terapeutici a base cellulare.
- Supporta la riduzione del rischio biologico preservando la vitalità e la funzionalità degli isolotti dopo il rivestimento.
- Facilita una previsione affidabile sulla sopravvivenza e sull'attecchimento cellulare ai fini della selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara isolotti standardizzati ed ingegnerizzati a livello della superficie per saggi funzionali successivi.
- Garantisce riproducibilità e valutazione quantitativa della vitalità degli isolotti e della secrezione di insulina.
- Permette una valutazione affidabile della protezione immunitaria e della vascolarizzazione nei flussi di lavoro di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per lo studio del trapianto di isole e della risposta immunitaria.
- Permette una continuità dalla progettazione in vitro alla validazione del trapianto in vivo.
- Fornisce una riduzione meccanicistica dei rischi per il mantenimento e la sopravvivenza cellulare nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di nanorivestimento si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, supportando la verifica delle ipotesi nelle fasi iniziali e consentendo una valida validazione preclinica delle terapie cellulari.
- Biologia della scoperta: Permette di avanzare nella verifica delle ipotesi relative ai meccanismi di evasioni immunitarie e alla sopravvivenza degli innesti.
- Screening: Fornisce risultati riproducibili e quantificabili sulla vitalità e funzionalità delle isole.
- Analisi: Offre parametri misurabili come la secrezione di insulina e le metriche di vascolarizzazione.
- Ricerca traslazionale: Collega gli studi di ingegneria in vitro a quelli di trapianto in vivo per l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a diversi tipi cellulari e mediatori funzionali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella sopravvivenza cellulare e nella protezione immunitaria.
- Valore operativo: Standardizza l'ingegnerizzazione della superficie cellulare con impatto minimo sulla vitalità cellulare.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosegui/non prosegui per i candidati alle terapie cellulari e riduce il rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei programmi terapeutici basati su cellule in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento cellulare, chimica di superficie e tecniche di nanorivestimento.
- Necessita dell'accesso a microscopia a fluorescenza e strumentazione analitica per la validazione.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per garantire la riproducibilità nella preparazione degli isolotti e nel rivestimento.
- È adattabile a diversi tipi cellulari e mediatori funzionali, come supportato dalla progettazione della piattaforma.
- I limiti pratici includono il mantenimento della vitalità cellulare e la garanzia di una copertura uniforme del rivestimento.
