Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

L'obiettivo generale della funzionalizzazione chimica della superficie delle nanoparticelle di HEV è fornire un approccio ripetibile e costante per la coniugazione di molecole mirate immunogeniche, terapeutiche e diagnostiche alla superficie delle nanoparticelle di HEV ai fini diagnostici e terapeutici.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della nanomedicina, come ad esempio come monitorare il targeting migliorato del cancro e la distribuzione dei nano-terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile, efficiente e molto più facile da ottenere rispetto alla generazione di ingegneria genetica.

Le procedure saranno dimostrate da Michelle Nguyen e Ivan Ruiz, assistenti di ricerca del nostro laboratorio.

Iniziare questo protocollo con la produzione e la purificazione delle nanoparticelle del virus dell'epatite E come descritto nel protocollo testuale.

Diluire i campioni di nanoparticelle di HEV tra 0,5 e due milligrammi per millilitro con MES 10 millimolare, pH 6,2 per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Ionizzare le griglie rivestite di carbonio mediante scarica al plasma di 40 milliampere per 30 secondi al fine di ottenere una superficie di carbonio idrofila. La superficie di carbonio idrofila delle griglie può durare solo 30 minuti dopo il trattamento con scarica al plasma. Dopo l'ionizzazione, tenere la griglia e le pinzette e aggiungere due microlitri del campione di nanoparticelle di HEV sulla griglia.

Dopo 15-30 secondi, asciugare la griglia con carta da filtro. Quindi lavare immediatamente la griglia con acqua doppio-distillata e asciugare nuovamente con carta da filtro. Aggiungere immediatamente due microlitri di acetato di uranile al due percento sulla griglia. Dopo 15 secondi, asciugare la griglia con carta da filtro. Lasciare essiccare le griglie campione ponendole in un armadio elettronico disidratante per tutta la notte.

A seconda del campione, potrebbe essere necessaria la microscopia elettronica criogenica o criomicroscopia elettronica per la visualizzazione e la caratterizzazione della struttura. Trasferire la griglia in un microscopio elettronico a trasmissione ed eseguire l'immagine con un ingrandimento compreso tra 10 e 80K. Le nanoparticelle di HEV appaiono al microscopio elettronico come proteine icosaedriche vuote, con un diametro di circa 27 nanometri, a causa dell'assenza di RNA virale.

Per eseguire la coniugazione in un unico passaggio tra nanoparticelle di HEV e biotina legata al maleimide, applicare innanzitutto le nanoparticelle di HEV a unità di dialisi mini. Dializzare le nanoparticelle contro PBS 0,01 molare a pH 7,4 per un'ora a temperatura ambiente seguendo il protocollo del produttore. Dopo la dialisi, trasferire le nanoparticelle di HEV in provette da 1,5 millilitri e misurare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Mescolare le nanoparticelle a una concentrazione di un milligrammo per millilitro con una quantità uguale di biotina-maleimide 100 micromolare e PBS 0,01 molare a pH 7,4 per ottenere un rapporto molare di uno a cinque. Dopo aver lasciato reagire tutta la notte a quattro gradi Celsius, rimuovere la biotina-maleimide non legata mediante una procedura con colonna di desalting centrifuga seguendo il protocollo del produttore. Analizzare i campioni mediante elettroforesi SDS-PAGE standard in condizioni riducenti.

Utilizzando le procedure standard, preparare un immunoblot chimiluminescente mediante streptavidina legata all'HRP e rilevare il segnale chimiluminescente mediante pellicola radiografica.

Per eseguire la coniugazione in due passaggi del ligando specifico per le cellule del carcinoma mammario, LXY30, sulle cisteine esposte sulla superficie dei nanoparticelle HEV, applicare innanzitutto i nanoparticelle a unità di dialisi mini e dializzare contro PBS 0,01 molare a pH 7,4 a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, trasferire i nanoparticelle HEV in provette da 1,5 millilitro e misurare la concentrazione proteica a 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Poi, mescolare 650 micromolare di maleimide-azide e 650 micromolare di alchino-LXY30 con 200 micromolare di solfato di rame e un millimolare di acido ascorbico. Questo genera LXY30 legato al maleimide a 650 micromolare. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, mescolare i nanoparticelle HEV a un milligrammo per millilitro con circa il 10% in volume di LXY30 legato al maleimide per ottenere un rapporto molare da uno a tre. Lasciare reagire per tutta la notte a quattro gradi Celsius. A causa della concentrazione relativamente elevata di LXY30-maleimide, le concentrazioni finali dei reagenti come il solfato di rame si riducono di circa dieci volte dopo il mescolamento. Per evitare danni ai nanoparticelle del virus dell'epatite E, un'alternativa è il metodo di coniugazione senza rame.

Rimuovere il click di maleimide LXY30 non legato mediante una colonna di desalting a centrifuga seguendo il protocollo del produttore. Mantenere le nanoparticelle di HEV legate a LXY30 a quattro gradi Celsius. Per eseguire la coniugazione in un unico passaggio delle nanoparticelle di HEV con LXY30 e del marcatore fluorescente Cy5.5, mescolare innanzitutto le nanoparticelle legate a LXY30 a una concentrazione di un milligrammo per millilitro con un volume uguale di marcatore fluorescente Cy5.5 per ottenere un rapporto molare di uno a cinque. Dopo aver lasciato reagire la miscela tutta la notte a quattro gradi Celsius, rimuovere il Cy5.5 NHS non legato mediante una procedura con colonna di desalting a centrifuga seguendo il protocollo del produttore. Mantenere le nanoparticelle di HEV legate a LXY30 e Cy5.5 a quattro gradi Celsius.

Sono stati tentati due metodi per la funzionalizzazione con LXY30 di nanoparticelle HEV al fine di indirizzarle verso cellule tumorali. Quando le nanoparticelle HEV 573C sono state legate prima all'azide maleimilica, seguito da una reazione di chimica click con l'alkine LXY30, le nanoparticelle HEV 573C sono apparse disassemblate all'osservazione al TEM. Tuttavia, una reazione iniziale di chimica click tra l'alkine LXY30 e l'azide maleimilica per formare LXY30 legato al maleimide, seguita dalla coniugazione a nanoparticelle HEV modificate, non ha alterato la loro struttura e le nanoparticelle HEV 573C sono rimaste integre. Le nanoparticelle HEV legate a LXY30 e Cy5.5 sono state applicate a cellule di cancro al seno in coltura e osservate mediante microscopia confocale. Le immagini di fluorescenza nell'infrarosso vicino ottenute mediante microscopia confocale indicano che le nanoparticelle HEV legate a LXY30-Cy5.5 presentano un'affinità di legame maggiore e un'internaizzazione aumentata nelle cellule tumorali del seno MDA MB-231 rispetto alle nanoparticelle HEV legate solo a Cy5.5.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'esame di molecole multimodali per il targeting e terapeutiche che consentono un indirizzamento preciso e la diagnosi del tumore senza causare danni alle cellule normali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul targeting del cancro e dei tumori attraverso la modulizzazione chimica della superficie, può essere applicato alla diagnosi precoce del cancro, al screening e al trattamento guidato da imaging.