Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Questo metodo è ottimizzato con successo per classificare i pazienti con carcinoma mammario in gruppi terapeutici noti e non noti. L'elevata sensibilità di questo test identifica campioni eterogenei che possono essere ulteriormente studiati utilizzando la microdissezione laser. Il vantaggio principale del test multiplex basato sull'RNA è la riproducibilità dei risultati utilizzando ematossilina e materiale d'archivio con oposilina colorato con formalina, paraffina fissata con paraffina, che consente output ad alta risoluzione e convalida dei biomarcatori.

Preparare il fazzoletto come descritto nel protocollo di testo. Per iniziare la dissezione, impostare i limiti del vetrino e calibrare il movimento del tavolino del microscopio. Ora scansiona i vetrini della membrana colorati utilizzando l'obiettivo 4X.

Selezionare e circondare le aree target per la microdissezione sul vetrino a membrana. Tieni traccia dell'area totale. Sono necessari almeno 42 millimetri quadrati per un'adeguata analisi dell'RNA a valle.

Quindi avviare il taglio laser ai parametri definiti. Quindi, utilizzare il meccanismo di sollevamento del tappo per recuperare la sezione sezionata e posizionare la sezione sul cappuccio del diffusore di un tubo etichettato collegato a un'appendice meccanica. Se la sezione sezionata non viene recuperata sul cappuccio, ripetere la dissezione dell'area target.

L'accuratezza della microdissezione è un passaggio critico e si dovrebbe sempre assicurarsi che l'area microdissezionata presente sul cappuccio coincida con l'immagine contrassegnata e scansionata. Raccogliere tutte le sezioni di tessuto desiderate, ciascuna in una provetta separata, quindi procedere con la lissi dei campioni di tessuto. Per la lisi, applicare 2,4 microlitri di soluzione omogeneizzante pre millimetro quadrato di area tissutale in ciascun campione, quindi agitare i campioni per 10 secondi alla massima velocità.

Quindi, centrifugare i campioni per cinque secondi a 2.500 g. Quindi, se necessario, trasferire i campioni in provette da 1,5 millilitri e metterli in un blocco riscaldante a 65 gradi Celsius. Agitarli a 600 giri/min per 12-18 ore.

Quindi centrifugare i lisati a 21.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Raccogliere con cura il surnatante trasparente in un nuovo tubo etichettato. Evitare di trasferire frammenti di tessuto.

I surnatanti possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. Dopo aver preparato tutti i reagenti per il test basato sull'ibridazione, caricare fino a 90 pozzetti di una piastra a separazione magnetica da 96 pozzetti con 25 microlitri di omogeneizzato tissutale. Caricare 25 microlitri di campioni di controllo in tre pozzetti designati e caricare una soluzione omogeneizzante da 25 microlitri in tre pozzetti come bianchi.

Quindi sigillare la piastra di separazione magnetica utilizzando un sigillo a pressione in plastica trasparente e posizionare la piastra in un'incubatrice a 54 gradi Celsius per 18-22 ore con agitazione. Il giorno successivo, montare e bloccare la piastra su una lavatrice per piastre magnetiche portatile, quindi rimuovere la guarnizione a pressione e attendere un minuto affinché le perline magnetiche si depositino. Ora esegui un lavaggio.

Scolare la piastra sopra un lavandino e utilizzare una carta velina per asciugarla delicatamente, quindi caricare tutti i pozzetti con 100 microlitri di tampone di lavaggio 1X e attendere 15 secondi. Ripetere questo processo tre volte per completare la fase di lavaggio. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio, ricaricare i pozzetti con 50 microlitri di reagente preamplificatore, quindi sigillare la piastra con un sigillante per piastre in alluminio e agitare la piastra a 800 giri/min per un minuto a temperatura ambiente.

Quindi continuare ad agitare la piastra a 50 gradi Celsius per un'ora. Al termine, eseguire un'altra fase di lavaggio. Quindi, ricaricare i pozzetti con 50 microlitri di reagente dell'amplificatore, sigillare la piastra con un sigillo di alluminio e ripetere l'incubazione con agitazione di un minuto a temperatura ambiente seguita da un'ora a 50 gradi Celsius, seguita da un'altra fase di lavaggio.

Ora agitare la sonda di etichetta per 10 secondi alla massima velocità e poi aggiungere 50 microlitri di sonda di etichetta a ciascun pozzetto. Quindi richiudere la piastra e ripetere l'incubazione con agitazione come prima, seguita da un'altra fase di lavaggio. Caricare quindi i pozzetti con 50 microlitri di streptavidina ficoeritrina appena miscelata, quindi eseguire un'incubazione di agitazione a temperatura ambiente a 600 giri/min, seguita da una fase di lavaggio con tampone di lavaggio streptavidina.

Dopo aver completato la fase di lavaggio, caricare ogni pozzetto con 100 microlitri di tampone di lavaggio Streptavidin e sigillare la piastra con una guarnizione in alluminio, quindi agitare la piastra a 800 giri/min a temperatura ambiente per tre minuti. Durante l'ultima fase di incubazione, avviare l'analizzatore di biglie magnetiche e assicurarsi che lo strumento sia calibrato e che siano stati eseguiti i protocolli di convalida. Nel software, aggiungere una nuova analisi selezionando Crea batch utilizzando un protocollo esistente dalla scheda Batch.

Successivamente, nel layout della piastra, designare i pozzetti come sconosciuti o vuoti e fornire un'etichetta per ciascuno nel pannello Campione. A questo punto, rimuovere la guarnizione in alluminio dalla piastra di reazione, espellere il vassoio del caricatore di piastre e caricare la piastra nell'analizzatore. Quindi, fare clic su Ritrai, quindi su Esegui batch per avviare l'analizzatore.

Dopo la lettura, espellere la piastra e pulire l'analizzatore di microsfere magnetiche come raccomandato dal produttore. Per l'analisi, vai alla scheda Risultati batch. Seleziona il rispettivo file di analisi e utilizza l'opzione per esportarlo come file csv, quindi crea medie e punteggi grezzi utilizzando un software per fogli di calcolo.

Assicurarsi che i controlli mostrino i segnali previsti. Normalizza i dati grezzi del campione e analizza la distribuzione dei dati utilizzando una piattaforma di data science o utilizzando algoritmi definiti per eseguire un'analisi dei componenti principali. Le prestazioni del lettore di microsfere multiplex e del test sono fondamentali e l'esecuzione di diluizioni seriali di campioni di controllo ben annotati prima di preziosi campioni di pazienti garantisce risultati corretti.

Per gli attributi, selezionare il sottoinsieme di dati genici normalizzati e una variabile nominale, ad esempio un sottotipo di cancro al seno. Applicare un algoritmo di classificazione addestrato e convalidato per caratterizzare campioni sconosciuti. Il metodo descritto è stato applicato per la misurazione simultanea di 40 trascritti in materiale FFPE altamente degradato colorato con H&E, microdissezionato e altamente degradato.

Utilizzando questo metodo, è possibile mostrare un'accurata caratterizzazione dello stato recettoriale e dell'espressione differenziale del marcatore mesenchimale FN1 confrontando il tumore e il tessuto di controllo abbinato nei vari sottotipi positivi e negativi del recettore. L'eterogeneità all'interno dei tumori può essere caratterizzata utilizzando questo metodo. Un tumore ER positivo mostra un'espressione differenziale spaziale di FN1 all'interno di aree che mostrano una morfologia tumorale e un'attività mitotica distinte.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare più geni direttamente dai lisati tissutali in seguito all'ibridazione dell'RNA bersaglio in perline, all'amplificazione del segnale e alla quantificazione. La sensibilità del saggio consente l'uso di materiale microsezionato al laser. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di calibrare l'apparecchiatura prima di ogni test e di determinare l'intervallo di sensibilità utilizzando materiale di controllo qualità prima di eseguire l'analisi di preziosi campioni di pazienti.

Il flusso di lavoro del test è facilmente adattabile ai laboratori clinici. La profilazione dell'RNA di un massimo di 90 campioni può essere eseguita in 12 ore nell'arco di due giorni. Misurare lo stato del recettore del cancro al seno in un laboratorio di patologia richiede tempo e patologi esperti.

L'utilizzo di questo test digitalizzato basato su microsfere multiplex quantifica accuratamente l'espressione dell'RNA. L'analisi dei biomarcatori frazionari nelle biopsie in una diagnosi primaria è una presentazione del tumore. L'utilizzo di questa metodologia con un pannello di biomarcatori più ampio e l'utilizzo di intere sezioni identifica campioni eterogenei.

Lo sviluppo di saggi che utilizzano questa metodologia è versatile e richiede un basso apporto di campione. I campioni includono campioni clinici annotati importanti per la convalida dei biomarcatori e anche biopsie liquide che sono importanti per la sorveglianza del paziente e la diagnosi precoce.