Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana
7 marzo 2018
Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l'associazione del ricevitore dell'ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.
L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare le interazioni sensibili ai detergenti tra le proteine di membrana o altre proteine. Questa procedura richiede che una proteina sia marcata con istidina e sovraespressa nelle cellule, mentre l'altra è un peptide marcato con myc. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della biochimica, importanti studi di interazione proteica.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di rilevare l'interazione tra le proteine di membrana in modo sensibile ai detergenti. La procedura è facile e veloce. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni proteiche di membrana, può anche essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche deboli.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo verificare l'interazione tra le proteine di membrana, Saltilin e GLUT4, ma i tentativi di co-immunoprecipitarle dalla lisi dei mammiferi rimangono infruttuosi. Per effettuare un ordine per il peptide, selezionare la sequenza target del peptide critico per l'interazione e aggiungere un epitopo myc alla fine o al terminale C della sequenza. Una volta che il peptide è arrivato, pepare 100 microgrammi per millilitro di soluzione di lavoro del peptide in acqua ultra pura.
Seminare tre cellule pre-adipocitarie 3T3-L1 in quattro piastre di coltura da 10 centimetri e conservarle nell'incubatore. Successivamente, trasfettare due piastre di coltura con la proteina bersaglio marcata con istodina 6X ed etichettare come HISP nelle altre due piastre con due plasmidi di controllo ed etichettare come WT. Dopo la trasfezione, lasciare le cellule nell'incubatore per 48 ore per raggiungere l'80-90% di confluenza. Per preparare il lisato cellulare, lavare le cellule su ghiaccio tre volte con 10 millilitri di soluzione salina tamponata 1X raffreddata a quattro gradi Celsius.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi a ciascuno di essi. Quindi, staccare le cellule dai piatti utilizzando un raschietto cellulare per preparare il lisato. Trasferire il lisato cellulare preparato da ciascuna piastra di coltura in quattro provette separate da 1,5 millimetri ed etichettare tutte le provette.
Quindi, passare il lisato cellulare attraverso una siringa con ago da 26 gauge su e giù per cinque volte per la lisi cellulare totale. Quindi, centrifugare i lisati cellulari a 16000xg per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in quattro nuove provette etichettate in modo identico.
Per futuri esperimenti di risoluzione dei problemi e di controllo, aliquotare 20 microlitri di lisato cellulare e conservarlo a 20 gradi Celsius. Per un uso successivo, titolare il tampone di lavaggio a PH8 con acido cloridrico per ottenere PH6 e conservare il tampone a quattro gradi Celsius. Successivamente, per preparare una sospensione omogenea delle perle di cobalto, agitare con cura la bottiglia.
Quindi, trasferire 40 microlitri di sospensione di perle di cobalto in tutte le quattro provette contrassegnate individualmente. Dopo aver aggiunto le perle di cobalto, aggiungere un millilitro di tampone di lisi alle provette. Quindi, centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi.
Scartare il surnatante e pipettare 40 microlitri di tampone di lisi nelle perle depositate. Quindi, trasferire il lisato cellulare nelle provette corrispondenti e incubare a quattro gradi Celsius per 90 minuti su un rotatore di provette. Dopo 90 minuti, centrifugare i campioni a 1000xg per cinque secondi.
Quindi, raccogliere il surnatante etichettato Flowthrough-1 e conservarlo a 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio con PH8 ai singoli tubi e risospendere delicatamente le perle. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi ed espellere i surnatanti.
Quindi, aggiungere il tampone di lavaggio con PH8 con o sei ai tubi, secondo le etichette e risospendere bene le perline. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi ed espellere i surnatanti. Preparare un microgrammo per millilitro di soluzione di lavoro del peptide e del tampone acquoso con PH6 o otto.
Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione peptidica alle perle lavate corrispondenti a un PH simile. Quindi, incubare le perle a quattro gradi Celsius su un rotatore per tubi per 30 minuti. Quindi, prendere quattro microcolonne, etichettarle e posizionare le colonne in provette di raccolta etichettate Flowthrough-2. Al termine dell'incubazione, aggiungere la miscela di incubazione alle colonne.
Lasciare che la soluzione passi attraverso la forza gravitazionale e raccogliere il campione dal flusso. Posizionare le colonne in nuovi tubi di raccolta e conservarle a 20 gradi Celsius. Quindi, passare 500 microlitri di tampone di lavaggio con PH6 o otto mediante flusso gravitazionale attraverso le singole colonne ed eliminare il flusso.
Ripeti questo passaggio quattro volte. Centrifugare le provette a 1000xg per cinque secondi. Posizionare la colonna nella nuova provetta di raccolta etichettata Elution.
È importante lavare le perle in tutti i tubi con molta attenzione e allo stesso modo per eliminare il peptide non legato. Alle perle lavate, aggiungere 40 microlitri di tampone per campioni di tricina con beta mercaptoetanolo. Lasciate riposare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Centrifugare la colonna a 8000xg per due minuti. Scartare le colonne e riscaldare i tubi di raccolta a 100 gradi Celsius per 10 minuti. E poi, centrifugalo a 1000xg per cinque secondi.
In alternativa, aggiungere 40 microlitri di tampone Elution Imidazole alle perle lavate e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare le provette a 8000xg per due minuti. Scartare le colonne e aggiungere un campione di tricina da 40 microlitri.
Riscaldare le provette di raccolta a 100 gradi Celsius per 10 minuti, quindi centrifugarle a 1000xg per cinque secondi. Utilizzare i gel gradienti di tricina al 10-20% disponibili in commercio. Utilizzare il tampone di corsa Tris/Tricine/SDS, quindi caricare 20 microlitri ciascuno dei campioni eluiti e i lisati totali sul gel e iniziare a far funzionare l'unità di elettroforesi.
Una volta terminata l'elettroforesi, utilizzare un tampone di trasferimento integrato con il 20% di metanolo per trasferire il materiale dal gel su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 micrometri. Dopo aver bloccato la membrana, tagliarla orizzontalmente. Quindi, sonda la parte superiore della membrana con l'anticorpo Anti His P nella metà inferiore della membrana con anti myc.
Per studiare l'interazione tra la sortilina immobilizzata sulle perle di cobalto in GLUT4, è stata eseguita l'analisi immunoblot. I lisati cellulari e gli eluati sono stati ottenuti in cellule 3T3-L1 wild type e trasfettate con Sortilin-myc/His-tagged e quindi caricate sulla pagina SDS. Il blot è stato sondato con anticorpi anti-myc.
Il blot mostra un 110 kilodotin Sortili-myc/His-tagged e cinque kilotin myc-first luminal loop-GLUT4 dagli eluati trasfettati. Successivamente, per studiare l'importanza del PH e l'interazione tra la sortilina immobilizzata su perle di cobalto e GLUT4, è stata eseguita l'analisi immunoblot. In questo saggio, l'ansa luminale GLUT4 di Myc-first è stata incubata con perle immobilizzate con proteine marcate con Sortilin-myc/His-tagged sia a PH6 che a otto.
Il blot mostra una chiara interazione tra Sortilin-myc/His e myc-first luminal loop GLUT4 sia a PH6 che a otto dagli eluati ottenuti dalle cellule 3T3-L1 trasfettate con Sortilin-myc/His-tagged. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore fino a quando i campioni non sono pronti per l'analisi del sangue occidentale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di progettare un peptide solubile, preferibilmente in acqua.
Per rafforzare i risultati, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoprecipitazione dopo la reticolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare le proteine di membrana e le interazioni proteiche in una procedura sensibile ai detergenti. Permette anche di esplorare l'interazione tra frammenti proteici.
Jazz ritmico morbido.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per rilevare interazioni sensibili ai detergenti tra proteine di membrana, utilizzando il legame del recettore di sorting, sortilina, alla proteina trasportatrice del glucosio, GLUT4, come esempio. Il metodo è stato progettato per facilitare lo studio delle interazioni proteiche in un contesto biochimicamente rilevante.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biochimica
- Interazioni tra proteine di membrana
- Tecniche di marcatura delle proteine
Sfondo
- Comprendere le interazioni proteiche è fondamentale in biochimica.
- Le proteine di membrana spesso richiedono condizioni specifiche per lo studio delle loro interazioni.
- Metodi sensibili ai detergenti forniscono informazioni sulla dinamica di queste interazioni.
- La marcatura con istidina e con etichetta myc sono tecniche comuni utilizzate per il rilevamento delle proteine.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per rilevare le interazioni tra proteine di membrana.
- Evidenziare i vantaggi dell'utilizzo di tecniche sensibili ai detergenti.
- Fornire un protocollo rapido e semplice per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Overespressione di proteine con tag istidina in cellule.
- Utilizzo di un peptide con tag myc per studi sulle interazioni.
- Applicazione di saggi sensibili ai detergenti per rilevare interazioni proteiche.
- Analisi delle interazioni di legame tra sortilina e GLUT4.
Risultati principali
- Il protocollo rileva con successo le interazioni tra proteine di membrana.
- La sensibilità ai detergenti permette lo studio di interazioni proteiche deboli.
- I risultati dimostrano l'efficacia del metodo di marcatura.
- La procedura è efficiente e riproducibile per i ricercatori.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni preziose sulle interazioni tra proteine di membrana.
- Può essere applicato a diversi studi sulle interazioni proteiche.
- La ricerca futura potrà basarsi su questa tecnica per una comprensione più approfondita.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento di interazioni sensibili ai detergenti tra proteine di membrana affronta un'importante lacuna nella fase iniziale della scoperta, in cui la co-immunoprecipitazione convenzionale non riesce a catturare contatti luminari deboli o transitori. Questo saggio consente ai team della biopharma di validare le interazioni proteina-proteina in condizioni simili a quelle native, supportando la riduzione del rischio meccanicistica e la fiducia nel target durante la fase di selezione del portafoglio. L'adattabilità del metodo ad altri sistemi di proteine di membrana ne accresce il valore strategico per i flussi di R&S aziendali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi di interazioni deboli o transitorie tra proteine di membrana sensibili ai detergenti.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio confermando eventi di legame diretto in un contesto biochimico controllato.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici distinguendo vere interazioni biologiche da artefatti derivanti da condizioni di estrazione aggressive.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione di bersagli da avanzare verso screening successivi o flussi di lavoro di validazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi validati di interazione proteica per saggi quantitativi successivi e piattaforme di screening.
- Standardizza il rilevamento delle interazioni proteina-proteina mediante costrutti marcati e letture riproducibili tramite Western blot.
- Permette flussi di lavoro riproducibili e scalabili per valutare gli effetti di composti su complessi di proteine di membrana.
- Supporta lo sviluppo affidabile di saggi per studi sulle interazioni tra proteine di membrana in cui la sensibilità ai detergenti rappresenta un problema.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce informazioni meccanicistiche sulle interazioni di proteine di membrana rilevanti per le malattie, quando abbinato a strategie traslazionali di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla validazione nella fase di scoperta alla selezione dei modelli preclinici, confermando la specificità dell'interazione.
- Riduce il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto a interazioni proteiche deboli o dipendenti dal contesto non rilevate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione di composti promettenti, consentendo ai gruppi di lavoro di validare le interazioni delle proteine di membrana prima di destinare risorse a screening su larga scala o a studi preclinici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la conferma di contatti diretti proteina-proteina in condizioni simili a quelle native.
- Screening: Fornisce un risultato quantitativo e riproducibile per valutare l'intensità e la specificità dell'interazione mediante analisi Western blot.
- Analisi: Produce risultati misurabili (ad esempio, intensità della banda, presenza/assenza) per confrontare condizioni di interazione come la sensibilità al pH.
- Ricerca traslazionale: Si integra con le strategie per i biomarcatori quando le interazioni tra proteine di membrana sono coinvolte nei meccanismi delle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro modulare e adattabile per diversi sistemi di proteine di membrana, andando oltre l'esempio iniziale della sortilina-GLUT4.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di bersagli proteici di membrana.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo standardizzato, rapido e riproducibile per il rilevamento delle interazioni.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento/cessazione e una maggiore efficienza nell'uso del capitale, riducendo i rischi associati ai bersagli nelle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione mirata di bersagli proteici di membrana con interazioni validate, correggendo il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel marcare le proteine, nella coltura cellulare e nell'analisi mediante Western blot.
- Necessita dell'accesso a sistemi di espressione nei mammiferi, alla sintesi peptidica e a strumentazione analitica per immunoblotting.
- Richiede una rigorosa standardizzazione interdisciplinare delle condizioni dei tamponi e delle strategie di marcatura per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi sistemi di proteine di membrana, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per quanto riguarda la solubilità del peptide e il posizionamento del marcatore.
- È limitato alle interazioni rilevabili nelle condizioni biochimiche scelte; potrebbe non rilevare tutti i contatti fisiologicamente rilevanti.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Handling of the Peptide and Cells
3:02
Binding of His-tagged Proteins to the HisPur Cobalt Beads
4:39
Binding of the Peptide to the His-tagged Protein Immobilized on the Beads
5:59
Elution from Cobalt Beads
7:07
Electrophoresis, Western Blotting, and Analysis of Results
7:58
Results: Use of Immunoblot Assay to Study the Interaction between Sortilin Immobilized on Cobalt Beads and myc-tagged Peptide
9:18
Conclusion
