Un sistema di Microbiomechanical per lo studio della formazione del Varicosity e del recupero in centrale del neurone assoni

L'obiettivo generale di questa configurazione di fluido pressurizzato è quello di produrre rigonfiamenti ripetibili e coerenti lungo gli assoni dei neuroni in coltura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle lesioni cerebrali, come i meccanismi alla base dei cambiamenti morfologici subcellulari nei neuroni dopo una lesione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il metodo produce cambiamenti morfologici coerenti e ripetibili che si riprendono nel tempo.

Questa è una tecnica molto importante che abbiamo sviluppato in laboratorio. Questo perché non solo possiamo utilizzare il sistema per identificare il meccanismo molecolare che governa il cambiamento della morfologia degli assoni indotto dallo stress meccanico come una nuova forma di plasticità neuronale, ma anche utilizzare il sistema come strumento di screening per identificare nuovi farmaci e la strategia di trattamento per lesioni cerebrali lievi o traumatiche. Per iniziare questa procedura, posizionare una o più scatole di vetrini coprioggetti da 12 millimetri o 25 millimetri in un becher di vetro contenente il 70% di acido nitrico e incubare i vetrini coprioggetti a temperatura ambiente per una notte.

Il giorno successivo, trasferisci tutti i vetrini coprioggetti in un becher da quattro litri riempito con 2,5 litri di acqua bidistillata. Agitare il becher contenente i vetrini coprioggetti per un'ora a 100 giri/min e non dimenticare di utilizzare degli elastici per tenere il becher durante l'agitazione. Successivamente, trasferire i vetrini coprioggetti puliti in un pallone asciutto con il coperchio metallico.

Cuocete i vetrini in forno a 225 gradi Celsius per sei ore. Quindi, lasciali raffreddare a temperatura ambiente e conservali in un contenitore di plastica sterilizzato fino al momento dell'uso. Ora, posizionare un vetrino coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.

Aggiungere 30 microlitri di soluzione di rivestimento per vetrini coprioggetti su un vetrino coprioggetti da 12 millimetri e agitare. Successivamente, aggiungi un millilitro di PBS sterile a ciascun pozzetto. La piastra può essere utilizzata immediatamente o conservata a quattro gradi Celsius in PBS sterile per un massimo di una settimana.

Il giorno della dissezione, rimuovere il PBS dalla piastra. Asciugare all'aria e posizionare la piastra sotto la luce UV per due o quattro ore. Per dissociare i neuroni dell'ippocampo per la coltura, scongelare la soluzione dell'enzima proteasi e preriscaldare il mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius.

Quindi, sciacquare l'ippocampo sezionato con SLDS. Quindi, rimuoverlo e aggiungere due millilitri di soluzione di enzima proteasi e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavare due volte gli espianti di ippocampo con da cinque a 10 millilitri di terreno di placcatura e aggiungere cinque millilitri di terreno di placcatura.

Dissociare gli espianti ippocampali in singole cellule generando un piccolo vortice utilizzando una pipetta con punta di plastica da un millilitro. Pipettare su e giù circa 40 volte evitando la formazione di bolle di ossigeno fino a quando la soluzione diventa torbida e non rimangono grossi pezzi di espianto. Quindi, centrifugare le celle a 1, 125 volte la gravità per tre minuti.

Rimuovere il surnatante con le celle immerse nel terreno e risospendere le cellule in 145 millilitri di terreno di placcatura. Quindi, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule nel mezzo di placcatura a 37 gradi Celsius per due o quattro ore.

Successivamente, rimuovere il mezzo di placcatura e sostituirlo con un nuovo mezzo di manutenzione. Dopo due giorni, sostituire metà del terreno con due micromolari di RSC disciolti nel terreno di mantenimento per inibire la crescita dei fibroblasti, delle cellule endoteliali e gliali. Quindi, dopo aver esposto le cellule all'RSC per due giorni, sostituire il terreno con un nuovo terreno di mantenimento.

Per la trasfettazione per la visualizzazione della morfologia cellulare, diluire il costrutto da stock a un microgrammo per microlitro in terreno Opti-MEM e vortex. Quindi, diluire il reagente di trasfezione mediato da liposomi in terreno Opti-MEM e vortex. Successivamente, preparare una diluizione di costruzione e una diluizione di trasfezione per ciascun pozzetto.

Quindi, preparare una miscela uno-a-uno del costrutto e del mezzo Opti-MEM e del reagente di trasfezione e del terreno e del vortice Opti-MEM. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, rimuovere metà del terreno da ciascun pozzetto e trasferirlo in un tubo conico pulito.

Conservare la provetta nell'incubatrice, quindi aggiungere 100 microlitri della miscela preparata nel passaggio precedente al terreno rimanente nel pozzetto. Lasciare incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Durante l'incubazione, aggiungere un volume di terreno di mantenimento fresco al terreno nel tubo conico e posizionare la miscela nella stessa incubatrice.

Dopo l'incubazione, rimuovere i terreni contenenti la soluzione di trasfezione dai pozzetti e sostituirli con la miscela uno a uno di terreno di manutenzione vecchio e fresco nella provetta conica. In questa procedura, inserire la pipetta nella parte superiore della vite del micromanipolatore per tenerla in posizione. Avvitare la vite metallica a sommità piatta fissata al braccio del micromanipolatore in modo che tenga l'estremità non tirata della pipetta appena sopra il punto in cui è fissato il tubo di gomma.

Inclinare la pipetta di 45 gradi con la superficie del neurone contenente i vetrini. Attiva il filtro di florescenza. Apri l'apertura e assicurati che un punto fluorescente possa essere visto attraverso l'obiettivo.

Utilizzando il micromanipolatore, spostare la pipetta in una posizione che allinei la punta con il punto fluorescente e abbassare la pipetta in una posizione appena sopra l'altezza della capsula per colture cellulari. Una volta in posizione, accendere la luce trasmessa e spegnere la fioritura. Usando una pinzetta, trasferire un vetrino coprioggetti con le cellule rivolte verso la pipetta dalla piastra di coltura cellulare alla piastra di coltura cellulare contenente 2 millilitri di tampone di Hank a temperatura ambiente.

Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine e l'obiettivo a 20 pieghe, mettere a fuoco su un piano di circa quattro giri completi sopra le celle. Successivamente, utilizzare il micromanipolatore per posizionare la punta della pipetta in modo che sia focalizzata e al centro sul lato sinistro del piano come visto attraverso gli oculari. Una volta che la pipetta è in posizione, mettere a fuoco il microscopio su un piano che contenga la regione di interesse.

Nell'imaging di sette div, i neuroni ippocampali di topo trasfettati con GFP hanno mostrato un assone prima e dopo lo sbuffo, nonché un successivo periodo di recupero di 10 minuti. Ecco il chimografo dell'imaging time-lapse dello stesso neurone. Le frecce rosse indicano le varicosità che si sono formate dopo 150 secondi di sbuffo di H2O da 190 millilitri, a partire da 30 secondi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la registrazione di intere cellule, l'imaging FRET e TIRF time-lapse e l'imaging del calcio per rispondere a ulteriori domande come l'impatto dello stress meccanico sulla segnalazione neurale ed elettrica e del calcio, il traffico proteico e le interazioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle lesioni cerebrali fototraumatiche per spiegare i meccanismi molecolari alla base della formazione di varici assonali nei neuroni viventi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire gli esperimenti per studiare le meccanosensazioni dei neuroni centrali.