Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una tecnica per l'introduzione di microparticelle nel sistema circolatorio del pesce zebra adulto mediante iniezione nel rene del pesce. Le microparticelle introdotte vengono ulteriormente visualizzate nel sistema vascolare mediante una semplice tecnica di imaging intravitale nelle branchie dei pesci. Questa procedura può essere utilizzata, ad esempio, per effettuare misurazioni ripetute del pH del sangue di pesce in vivo mediante l'introduzione di sonde fluorescenti microincapsulate per il pH.

Per fare ciò, nella prima fase, il colorante sensibile al pH SNARF-1 coniugato con destrano viene incapsulato nel guscio di polielettrolita semipermeabile utilizzando l'approccio strato per strato. Il colorante fluorescente viene co-precipitato in micronuclei porosi di carbonato di calcio e i nuclei sono rivestiti con strati multipli di polimeri non biodegradabili caricati in modo opposto e rivestiti con un polimero biocompatibile contenente polietilenglicole. Successivamente, i nuclei di carbonato di calcio vengono risolti per ottenere intere microcapsule che racchiudono SNARF-1.

Nella seconda fase dell'anestesia e della fissazione del pesce, le microcapsule preparate vengono iniettate direttamente nel rene dell'animale per rilasciare il colorante incapsulato nel sistema circolatorio del pesce. Successivamente, è necessario un intervento chirurgico minimo per rimuovere la copertura branchiale e denudare i capillari delle branchie dei pesci. Quindi, la visualizzazione delle microcapsule nel sangue e la registrazione dello spettro fluorescente possono essere eseguite in vivo mediante microscopia intravitale per monitorare il pH del sangue.

Quando l'iniezione è stata eseguita correttamente, è possibile osservare microcapsule fluorescenti nelle branchie del pesce subito dopo la procedura. Lo spettro di florescenza della sonda incapsulata può essere registrato utilizzando uno spettrometro accoppiato a un microscopio a fluorescenza. SNARF-1 ha due picchi di emissione e il rapporto tra due lunghezze d'onda corrispondenti a tali picchi può essere utilizzato per misurare il pH.

La procedura proposta consente di erogare microcapsule fluorescenti nel sistema circolatorio dei pesci e di monitorare a distanza la fluorescenza nel sangue dei pesci in vivo. In caso di ricerca fisiologica, il vantaggio principale di questo metodo sono le misurazioni ripetute dei parametri ematici in piccoli animali da laboratorio, che di solito sono difficili da eseguire. Se si utilizza una sonda fluorescente sensibile alla luce, si consiglia di eseguire l'intera procedura in una stanza a luce ridotta.

Mescolare due millilitri di soluzione di un colorante fluorescente legato al polimero scelto, SNARF-1-destrano, con 0,6 millilitri di una soluzione molare di cloruro di calcio e 0,6 millilitri di una soluzione molare di carbonato di sodio sotto agitazione rapida. In questa fase, vengono sintetizzati micronuclei porosi di carbonato di calcio che racchiudono il colorante fluorescente. Dopo cinque, 10 secondi di agitazione, trasferire la sospensione in microprovette da due millilitri e centrifugare per 15 secondi in micronuclei di carbonato di calcio in pellet.

Scartare il surnatante, lavare i nuclei con circa due millilitri di acqua deionizzata e agitare la sospensione. Ripetere la centrifugazione e la procedura di lavaggio tre volte. Incubare la sospensione per un minuto in un bagno ad ultrasuoni per ridurre l'aggregazione dei micronuclei.

Risospendere i micronuclei di carbonato di calcio in circa due millilitri di una soluzione di quattro microgrammi per millilitro del polimero cationico IPA per depositare il primo strato polimerico sui modelli. Mantenere i micronuclei nella soluzione di pH per circa cinque minuti agitando costantemente. Dopo 15 secondi di centrifugazione, scartare il surnatante con IPA non legato e lavare i micronuclei con acqua tre volte mediante più fasi di centrifugazione e lavaggio.

Ripetere la stessa procedura con una soluzione di quattro milligrammi per millilitro di polimero anionico PSS per depositare il secondo strato polimerico sui modelli. Subito prima di aggiungere lo strato successivo, si consiglia di applicare un minuto di incubazione in bagno ad ultrasuoni. Ripetere in sequenza la deposizione di polimeri cationici e anionici sei volte per ottenere un guscio di microcapsule a 12 strati.

Successivamente, incubare i micronuclei con gusci nella poli-L-lisina innestata con polietilenglicole per almeno due ore. Quindi, lavare una volta i micronuclei coperti con acqua mediante centrifugazione sequenziale e risospensione. Infine, sciogliere i modelli di carbonato di calcio in due millilitri di soluzione di EDTA 0,1 molare, regolata a pH circa 7,1, per ottenere microcapsule cave.

Scartare il surnatante dopo una centrifugazione di 45 secondi e ripetere il lavaggio con EDTA due volte. Scartare il surnatante dopo una centrifugazione di 45 secondi e aggiungere due millilitri di soluzione fisiologica. Ripetere tre volte le fasi di centrifugazione del lavaggio con soluzione fisiologica.

Studiare la distribuzione dimensionale e la concentrazione delle microcapsule preparate in un emocitometro al microscopio a fluorescenza. Utilizzare ImageJ o un software equivalente per l'analisi dimensionale delle particelle. Conservare la sonda incapsulata ottenuta al buio.

Per preparare il sistema ottico, posizionare il set richiesto di filtri fluorescenti sul microscopio fluorescente in base alle caratteristiche del colorante fluorescente applicato e accendere la lampada fluorescente. Estrarre la leva degli oculari. Collegare la fibra ottica da un'estremità allo spettrometro e dall'altra estremità a un collimatore.

Utilizzando gli adattatori, far girare il collimatore nella messa a fuoco del tubo della fotocamera o di un'altra porta disponibile del microscopio a fluorescenza. Per la calibrazione delle microcapsule preparate, posizionare circa cinque microlitri della sospensione di microcapsule su un vetrino da microscopio e asciugare la goccia in un luogo buio. Accendi lo spettrometro.

Eseguire il programma di controllo dello spettrometro e preparare lo spettrometro per le misurazioni. Per calibrare le caratteristiche spettrali del microincapsulato SNARF-1, utilizzare una serie di tamponi con pH diverso. Versare circa 10 microlitri di tampone di sodio sulle microcapsule essiccate con SNARF-1 e coprirle con un vetrino coprioggetti.

Posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio. Localizzare le microcapsule utilizzando un ingrandimento di circa 400. Ruotare la leva del microscopio sulla porta della fotocamera.

Registrare la fluorescenza con lo spettrometro. Assicurati che il segnale spettrale sia ben oltre il livello di fondo e osserva che le microcapsule non sono in una bolla. Evitare l'illuminazione prolungata delle stesse microcapsule poiché SNARF-1 è sensibile al fotosbiancamento.

Riportare la leva sugli oculari. Calcolare il rapporto tra l'intensità di fluorescenza di SNARF-1 incapsulato alla lunghezza d'onda corrispondente ai picchi di emissione del colorante protonato e deprotonato. Costruire una curva di calibrazione del rapporto in base al pH del fluido.

Raccogli circa 10 microlitri di sangue dai pesci soppressi. Determinare il suo pH con un pHmetro con un microelettrodo. Quindi, far cadere il sangue sul vetrino con microcapsule essiccate e registrare il rapporto tra l'intensità della fluorescenza come descritto per i tamponi di calibrazione.

Poiché è necessario prendere in considerazione l'influenza dei componenti del sangue sulla lettura di SNARF-1 incapsulato, regolare il coefficiente lineare della curva di calibrazione per fare in modo che la curva corrisponda alle misurazioni nel sangue di pesce. Per preparare l'ago per l'iniezione, rilasciare un ago d'acciaio dalla punta della siringa da insulina rimuovendo la plastica con una lancetta affilata. Inserire l'ago a metà nel microcapillare di vetro.

Saldarlo rapidamente e delicatamente con una torcia a gas. Collegare il microcapillare di vetro al microiniettore e sciacquarlo con acqua sterile per tre volte. Assicurarsi che il liquido scorra attraverso l'ago.

Riempire il sistema con acqua. Assicurarsi che non ci siano bolle nel sistema. Il giorno dell'esperimento, assumere la sospensione preparata di microcapsule in soluzione fisiologica sterile contenente da mezzo a sei milioni di microcapsule per microlitro.

Rimetterlo in sospensione con il bagno ad ultrasuoni per un minuto. Durante l'iniezione successiva, agitare periodicamente il flaconcino per risospendere le microcapsule e prevenirne l'aggregazione. Usando un cucchiaio, togliete il pesce dall'anestesia e posizionatelo delicatamente su una spugna umida in posizione laterale con la testa verso sinistra se siete destrimani o verso destra se siete mancini.

Poco prima dell'iniezione, aspirare uno o due millimetri di aria nel capillare di vetro collegato con il microiniettore. Quindi, caricarlo con circa due microlitri delle microcapsule disperse. Stabilizza delicatamente il corpo del pesce sulla spugna con la mano non dominante.

Trova la linea laterale del pesce. Metti l'ago un millilitro sotto il punto medio di un segmento addominale della linea laterale. Quindi, con un movimento raschiante, spostare da parte la squama di pesce e praticare una foratura.

Inserire l'ago nel corpo con un angolo di 45 gradi rispetto alla superficie del tavolo. Spingi l'ago verso la colonna vertebrale finché non si appoggia con cura contro la colonna vertebrale. Quindi, rilasciare lentamente circa un microlitro della sospensione di microcapsule nel rene e ritirare lentamente l'ago.

Sciacquare il pesce dalla testa alla coda con un getto d'acqua per rimuovere le microcapsule versate nel sito di iniezione. Usa le forbici da dissezione per rimuovere la copertura branchiale dalla testa del pesce e denudare le branchie del pesce. Sciacquare le branchie con acqua.

Usando un cucchiaio, trasferisci il pesce su un vetrino da microscopio e posizionalo sul tavolino di un microscopio fluorescente. Quando si eseguono le seguenti procedure, assicurarsi che le branchie del pesce non si secchino. Per fare questo, inumiditeli periodicamente con acqua utilizzando una pipetta Pasteur.

Oscura la stanza e usando un basso ingrandimento ispeziona le branchie per trovare microcapsule fluorescenti. Quando lo trovi, cambia l'obiettivo su una magnitudine più alta e posizionalo al centro del campo visivo. Ruotare la leva sulla porta con uno spettrometro collegato.

Registra il segnale spettrale. Riportare la leva sugli oculari. Ripetere più volte le misurazioni per diverse microcapsule.

Trasferisci i pesci nell'acquario con un'adeguata aerazione per il recupero. La procedura di misurazione può essere ripetuta per un individuo per più volte con l'uso di anestesia ripetuta o un altro metodo di fissazione. L'immagine mostra un esempio rappresentativo di misurazioni in vivo del sangue di zebrafish e dell'ipercapnia mediante colorante fluorescente incapsulato SNARF-1.

In condizioni di controllo, il pH del sangue rimane stabile durante quattro ore dopo l'iniezione delle microcapsule, mentre cinque minuti di esposizione ad anidride carbonica elevata provocano l'acidificazione del sangue dei pesci. Durante l'esecuzione della procedura, è importante ridurre al minimo lo stress dell'animale causato dalla manipolazione e dalla chirurgia. Con un po' di pratica, sia l'iniezione che la registrazione del segnale richiedono in media circa due, tre minuti, quindi questo protocollo consente di completare le manipolazioni prima che il pesce si risvegli da una lieve anestesia.

Durante la procedura, assicurarsi che le branchie del pesce siano sempre inumidite. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un impianto semplice ed efficace di microparticelle nel sistema circolatorio di piccoli pesci. Come dimostrato, questa tecnica è molto conveniente per registrazioni ripetute in vivo del pH del sangue in zebrafish adulti utilizzando microcapsule riempite con una sonda fluorescente.