Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi

L'obiettivo generale di questa analisi dell'impronta delle dita dei piedi è osservare la formazione del complesso di inizio della traduzione sugli mRNA dei mammiferi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della traduzione dell'mRNA, come l'inizio della traduzione mediata da IRES. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può eseguire un'analisi dettagliata della formazione del complesso di inizio della traduzione su uno specifico mRNA.

Assemblare le reazioni di trascrizione per trascrivere l'RNA dai modelli di DNA amplificato con PCR, codificando l'RNA di XIAP IRES o i suoi mutanti. Quindi, aggiungi due unità di DNasi priva di RNasi per rimuovere il modello di DNA a ciascuna reazione di 20 microlitri di RNA. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Quindi, diluire l'RNA trattato con DNasi con acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 110 microlitri. Quindi, aggiungi 110 microlitri di fenolo acido per iniziare la purificazione dell'RNA. Agitare i campioni per cinque secondi e centrifugare a 20.000 x g per tre minuti a temperatura ambiente.

È fondamentale diluire l'RNA o il CDNA prima dell'estrazione del fenolo. Se il volume è troppo basso, sarà difficile recuperare fisicamente la fase acquosa e la resa finale sarà bassa. Quindi, trasferire con cura 100 microlitri di fase acquosa contenente RNA in una nuova provetta da microcentrifuga.

Aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio 3 M, pH 5,5, e mescolare i campioni. Quindi, aggiungere tre volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA e far vorticare i campioni per cinque secondi. Incubare per una notte a 20 gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare i campioni a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e ripetere la centrifugazione. Aspirare con cura quanto più surnatante possibile senza rimuovere il pellet.

Quindi, asciugare il pellet all'aria per cinque-10 minuti. Risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per microlitro. Per iniziare il test di impronta delle dita, aggiungere 15 microlitri di lisato di reticolociti di coniglio non trattato con nucleasi a ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, che rappresentano l'RNA XIAP IRES wild-type e i suoi mutanti.

Aggiungere l'inibitore della RNasi, l'ATP e il GMP-PNP a ciascuna provetta. Incubare a 30 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aggiungere un microlitro del rispettivo RNA a ciascuna delle provette e incubare a 30 gradi Celsius per altri cinque minuti.

Durante il periodo di incubazione, aggiungere DTT e spermidina al tampone per l'impronta delle dita dei piedi. Quindi, aggiungere 22 microlitri di tampone per l'impronta delle dita dei piedi a ciascuna delle provette e incubare a 30 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di primer per la stampa delle dita dei piedi etichettato con colorante IR e incubare la reazione su ghiaccio per 10 minuti.

Successivamente, aggiungere due microlitri di dNTP, due microlitri di acetato di magnesio e un microlitro di trascrittasi inversa del virus della mieoloblastosi aviaria. Portare il volume finale a 50 microlitri con il tampone per l'impronta delle dita. Quindi, lasciare che l'estensione del primer avvenga per 45 minuti a 30 gradi Celsius.

È anche fondamentale aggiungere acetato di magnesio alla reazione di impronta delle dita, senza il quale la trascrittasi inversa non funzionerà in modo ottimale. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere 250 microlitri di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico 25:24:1, pH 8,0, per iniziare la purificazione del cDNA.

Dopo aver agitato i campioni per cinque secondi, centrifugare i campioni a 20.000 x g a temperatura ambiente per tre minuti. Quindi, trasferire con cura la fase acquosa contenente il DNA in una nuova provetta da microcentrifuga. Quindi, aggiungi tre volumi di etanolo al 100% per far precipitare il DNA e vorticare per cinque secondi.

Incubare per una notte a 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare le provette a 20.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante. Quindi, lavare il pellet di DNA con 500 microlitri di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare quanto più surnatante possibile, facendo attenzione a non rimuovere il pellet. Quindi, asciugare il pellet all'aria per cinque-10 minuti. Sciogliere il pellet di DNA in sei microlitri di acqua priva di nucleasi.

Quindi, aggiungi tre microlitri di colorante per il caricamento della formammide. Utilizzare un kit di sequenziamento per preparare una scala di sequenziamento nucleotidico dideossidico con il primer per l'impronta delle dita dei piedi e il costrutto di DNA che codifica l'RNA XIAP IRES. Quindi, mescolare sei microlitri di ciascuna reazione di sequenziamento con tre microlitri del colorante di caricamento della formammide.

Dopo aver pulito e assemblato le piastre, versare il gel e inserire il pettine. Dopo la polimerizzazione del gel, assemblare l'apparato di sequenziamento e riempire i serbatoi con 1x TBE. Quindi, eseguire in anticipo a 1500 volt per 15 minuti fino a raggiungere una temperatura di 55 gradi Celsius.

Riscaldare tutti i campioni con colorante formamidico a 85 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, caricare un microlitro di ciascun campione su un gel di sequenziamento di poliacrilammide al 6% e far funzionare il gel a 1500 volt per otto ore. Infine, leggi le bande in tempo reale con un imager a fluorescenza.

Questo metodo dimostra che la conferma dell'RNA è fondamentale per la formazione del complesso di inizio della traduzione. La trascrizione inversa del complesso ribosomiale dell'mRNA di XIAP produce tipiche impronte di dita da 17 a 19 nucleotidi a valle di AUG. Il mutante 5'PPT mostra un'alterata formazione dell'impronta delle dita.

Tuttavia, quando trascritto con il 5'cappuccio, si verifica la formazione del complesso di iniziazione. Allo stesso modo, anche il mutante 3'PPT mostra una ridotta formazione dell'impronta delle dita. Tuttavia, la trascrizione con il 5'cap porta alla formazione del complesso di iniziazione.

Il doppio mutante PPT che ospita entrambe le mutazioni 5'PPT e 3'PPT è in grado di formare il complesso di iniziazione senza il 5'cap. La formazione dell'impronta delle dita è fortemente compromessa per il mutante del codone iniziale in assenza di RRL e GMP-PNP e di una coda Poly A. I prodotti CDNA sono confrontati con una scala di sequenziamento diossinucleotidico.

La beta globina umana, o mRNA HBB, non mostra alcuna impronta del piede in assenza del 5'cappuccio. Tuttavia, il complesso di iniziazione si forma sul 5'UTR incappucciato di HBB, producendo impronte di 16-18 nucleotidi a valle di AUG. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni, compresa la preparazione di modelli di trascrizione in vitro e RNA, se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sondaggio strutturale per rispondere a ulteriori domande come la struttura secondaria delle varianti wild-type o mutanti dell'IRES. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della traduzione dell'mRNA per esplorare la traduzione mediata da IRES in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'impronta delle dita dei piedi dell'mRNA dei mammiferi e analizzare la formazione di complessi di inizio della traduzione.

Non dimenticare che acido-fenolo, fenolo:cloroformio:alcol isoamilico e acrilammide possono essere estremamente pericolosi. Durante l'utilizzo di questi reagenti devono essere indossati dispositivi di protezione individuale adeguati.