Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari
4 luglio 2018
Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia molecolare, coinvolgendo saggi che richiedono specifici stadi di sviluppo di C.elegans. Come i saggi dei livelli di espressione genica e proteica. Il vantaggio di questa tecnica è che consente una selezione accurata ed efficiente di un gran numero di C.elegans in base alle dimensioni del corpo, questo facilita l'uso di saggi che normalmente sarebbero proibitivi in termini di tempo e costi.
In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non possono eseguire la fase di turnover ad arco o non mantengono il flusso della soluzione al centro della rete. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di lavaggio e capovolgimento sono difficili da imparare. Alcuni potrebbero avere difficoltà a interpretare e visualizzare movimenti specifici nel testo.
Per iniziare, procurati due provette coniche da 50 ml con coperchio, quindi usa una punta da trapano a gradini per rimuovere il centro dal labbro interno dei coperchi. Se necessario, utilizzare una lima, carta vetrata o uno strumento rotante per pulire e carteggiare i bordi e la parte superiore dei coperchi. Tagliate quindi un disco di rete tessuta in monofilamento di nylon, leggermente più piccolo del diametro del coperchio.
Strutturare le superfici superiori dei coperchi e pulirle con etanolo. Dopo aver lasciato asciugare i coperchi, applicare la colla cianoacrilica sulle superfici superiori di entrambi i coperchi. Quindi, appoggia il disco a rete monofilamento su un coperchio incollato.
Capovolgere il secondo coperchio sopra la rete e premere saldamente i coperchi insieme. Dopo che il primo strato di colla si è asciugato, applicare un generoso anello di colla cianoacrilica attorno allo spazio esterno tra i coperchi. Quindi, etichettare il filtro con la rispettiva dimensione dei pori della maglia.
Per prima cosa, posizionare il setaccio su una provetta conica da 50 ml etichettata. Quindi pipettare la soluzione salina attraverso il centro del setaccio fino a quando non si forma una gocciolina, che si fonde e gocciola dal centro del filtro. Utilizzando il tampone M9, lavare una popolazione di C.elegans da una piastra a coclea, quindi utilizzare una pipetta pasteur in vetro per trasferire il tampone contenente i vermi sul lato superiore della rete monofilamento.
Operando al centro della rete, sciacquare il filtro con un tampone M9, ripetere questa fase di risciacquo secondo necessità per far passare tutti i batteri e i vermi più piccoli attraverso la rete. Quindi, collegare una nuova provetta conica da 50 ml alla parte superiore del setaccio, i vermi precedentemente raccolti più grandi dei pori nella rete saranno rivolti verso l'interno della nuova provetta. Rimuovere il tubo di scarico e capovolgere rapidamente il setaccio.
Quindi sciacquare la rete con tampone M9 nella nuova provetta di raccolta. Lasciare riposare i vermi raccolti per circa un minuto, quindi aspirare con cura la soluzione tampone lontano dal pellet di vermi. Usando una pipetta di vetro pasteur, creare goccioline di vermi su una piastra NGM e lasciarle asciugare.
Infine, sciacquare il setaccio con acqua ad osmosi inversa ed etanolo. Dopo che il setaccio si è asciugato, conservarlo in un contenitore pulito per un uso futuro. Scartare il setaccio quando sviluppa un aspetto cadente.
In questo protocollo è stato costruito un setaccio per selezionare e pulire popolazioni di C. elegans di pari età. Gli animali nel gruppo di trattamento al setaccio hanno mostrato un modello di movimento normale e spontaneo per tutta l'età adulta. Inoltre, i gruppi di prelievo e setaccio non hanno mostrato differenze significative nella velocità della pompa faringea.
Gli animali nel gruppo setaccio hanno anche risposto normalmente allo stimolo meccanico anteriore o posteriore rispetto a tutti i gruppi di trattamento in uno qualsiasi dei giorni di test. Infine, è stata confrontata la fecondità dei gruppi di trattamento; L'uso del setaccio non ha avuto un impatto significativo sul numero di progenie rispetto al gruppo di trattamento con pick. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di dieci minuti.
Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di operare al centro dell'area della rete. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare e utilizzare correttamente un setaccio Caenorhabditis per ordinare i vermi in base alle dimensioni del corpo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una metodologia per la selezione e la pulizia di popolazioni di Caenorhabditis elegans di età corrispondente, utilizzando uno strumento appositamente realizzato. Consente ai ricercatori di ottenere in modo efficiente ed economico una popolazione sperimentale di grandi dimensioni.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia Molecolare
- Biologia dello Sviluppo
Sfondo
- Stadi specifici dello sviluppo di C.elegans sono cruciali per diversi saggi.
- I saggi possono riguardare i livelli di espressione genica e proteica.
- I metodi tradizionali possono richiedere molto tempo ed essere costosi.
- Le dimostrazioni visive sono essenziali per comprendere la metodologia.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo efficiente per la selezione di C.elegans in base alle dimensioni corporee.
- Facilitare saggi che richiedono stadi di sviluppo specifici.
- Migliorare l'accessibilità per i ricercatori alle prime armi con questa tecnica.
Metodi Utilizzati
- Strumento su misura per la selezione dei nematodi.
- Fase di ribaltamento ad arco per un lavaggio efficace.
- Mantenimento del flusso della soluzione al centro della maglia.
- Dimostrazioni visive per facilitare l'apprendimento.
Risultati principali
- Selezione accurata di un elevato numero di C.elegans raggiunta.
- Il metodo riduce il tempo e il costo degli esami di biologia molecolare.
- Migliore comprensione di movimenti specifici grazie a supporti visivi.
- Maggiore accessibilità per ricercatori non familiari con il metodo.
Conclusioni
- Il protocollo offre un metodo affidabile per il sorting di C.elegans.
- Gli ausili visivi sono fondamentali per l'apprendimento efficace della tecnica.
- Questa metodologia può apportare benefici significativi alla ricerca in biologia molecolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Nella ricerca e sviluppo di biotecnologie farmaceutiche, ottenere popolazioni sincronizzate di organismi modello come C. elegans è fondamentale per saggi riproducibili di screening fenotipico e di validazione degli obiettivi. Il Caenorhabditis Sieve consente un'ordinazione rapida ed economica in base alla dimensione corporea, riducendo i tempi e il carico di risorse nei flussi di lavoro delle prime fasi della scoperta. Ciò aumenta l'affidabilità predittiva della prontezza dei saggi e del triage del portafoglio, garantendo ingressi biologici uniformi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche utilizzando popolazioni di vermi di età comparabile per ottenere letture fenotipiche costanti.
- Valore operativo: Fornisce un metodo economico e scalabile per generare coorti sincronizzate senza l'uso di attrezzature specializzate.
- Valore predittivo: Riduce la variabilità biologica nei saggi, migliorando l'affidabilità dei dati per la riduzione del rischio dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi isolando stadi di sviluppo specifici.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei vermi, migliorando la riproducibilità tra piastre saggiali e campagne di screening.
- Scalabilità: Soddisfa le esigenze di alto rendimento consentendo l'elaborazione rapida di grandi popolazioni di vermi in meno di dieci minuti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la fedeltà fenotipica dalla scoperta alla validazione preclinica, preservando i marcatori di motilità, risposta allo stress e fecondità.
- De-risking Meccanicistico: Permette una valutazione affidabile dei livelli di espressione genica e proteica in popolazioni sincronizzate, favorendo l'allineamento dei biomarcatori.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Facilita decisioni di avanzamento o interruzione fornendo input costanti del sistema modello per la caratterizzazione di efficacia e tossicità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il Caenorhabditis Sieve si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla Fase Iniziale di Scoperta all'Identificazione del Compound Leader, supportando in particolare la preparazione dei saggi e la riproducibilità dello screening per schermate fenotipiche basate su C. elegans.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo popolazioni uniformi di vermi per la chiarificazione dei percorsi metabolici e lo screening funzionale.
- Screening: Permette la preparazione dei saggi attraverso il raggruppamento in base alle dimensioni, garantendo dimensioni e stadi uniformi dei vermi per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Produce risultati quantitativi separati per dimensione che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare le condizioni attraverso diversi stadi di sviluppo riducendo il rumore di fondo.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica mantenendo indicatori chiave di salute (motilità, risposta allo stress, fecondità) dopo il sorting, sostenendo la validità dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come strumento riutilizzabile e a bassa manutenzione all'interno di diversi team e progetti, promuovendo la standardizzazione nella gestione degli organismi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei saggi fenotipici.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro di preparazione dei vermi.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate mediante una riduzione precoce dei rischi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su dati affidabili provenienti da sistemi modello specifici per ogni fase.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze di base in laboratorio per il montaggio dei setacci e la manipolazione delle soluzioni.
- Necessita dell'accesso a provette coniche, rete in nylon, colla cianoacrilica e tamponi standard (M9, soluzione salina).
- Richiede una formazione condivisa tra i gruppi sul corretto utilizzo centrato sulla rete e sulla tecnica di capovolgimento, per garantire coerenza.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la scelta della dimensione dei pori della rete in base agli stadi target dei vermi e la compatibilità con diversi sistemi di coltura su NGM o in liquido.
- I limiti pratici comprendono il possibile cedimento della rete nel tempo, che richiede sostituzioni periodiche per mantenere l'accuratezza del processo di selezione.
