Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana
15 febbraio 2019
L'obiettivo del presente protocollo è illustrare come indurre cluster stomi nei cotiledoni di Arabidopsis thaliana piantine dal trattamento ad immersione con una soluzione di media contenenti zucchero e come osservare strutture intracellulari quali cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia in cluster utilizzando confocale microscopia laser.
Questo metodo ha risposto a una domanda chiave sulla biologia dello sviluppo vegetale. Cioè, qual è l'importanza della distribuzione spaziale degli stomi? Il nostro sistema di induzione per stomi raggruppati che utilizzano soluzione di saccarosio è abbastanza semplice e direttamente applicabile alle linee transgeniche o mutanti della arabidopsis thaliana.
Per iniziare, aggiungere 1,1 grammi di sali medi Di Murashige-Skoog e 15 grammi di saccarosio a un becher. Aggiungere 490 millilitri di acqua distillata al becher e mescolare con la barra di agitazione. Utilizzare idrossido di potassio per regolare il pH a 5,8.
Quindi diluire la soluzione con 500 millilitri di acqua distillata e trasferire la soluzione diluita in una bottiglia media. Dopo questo, autoclave la soluzione. Preparare la soluzione di sterilizzazione secondo il protocollo di testo.
Quindi, lavorando in condizioni asettiche, posizionare circa 50 semi transgenici di A.thaliana che trasportano un marcatore fluorescente in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere quindi un millilitro di 70% di etanolo al tubo e mescolare invertendo il tubo cinque volte. Dopo aver permesso ai semi di affondare sul fondo del tubo, rimuovere delicatamente l'etanolo con una micropipetta.
Aggiungere un millilitro di soluzione di sterilizzazione ai semi e invertire il tubo cinque volte per mescolare. Rimuovere delicatamente la soluzione di sterilizzazione dai semi con una micropipetta. Quindi aggiungere un millilitro di acqua sterile.
Aggiungere 1,5 millilitri della soluzione Murashige-Skoog ad ogni pozzo di una piastra da 24 poggiagli. Quindi aggiungere due semi sterilizzati ad ogni pozzo. Utilizzando due strati di parafilm, rastreliare il coperchio sulla piastra.
Quindi, trasferire il piatto in una camera di crescita per incubare per 14 giorni. In primo luogo, trasferire 30 microlitri della soluzione Murashige-Skoog dalla piastra del pozzo 24 al centro di uno scivolo di vetro. Usando le forbici sezionanti, rimuovere la cotiledone da una piantina vecchia di 14 giorni.
Galleggiare il cotiledone con il lato di osservazione rivolto verso l'alto sulla goccia della soluzione Murashige-Skoog. Preparare il cotiledone secondo i metodi precedentemente descritti nel Journal of Visualized Experiments. Impostare il campione sul palco di un microscopio laser confocale.
Infine, utilizzare l'illuminazione del campo luminoso per selezionare le celle di guardia raggruppate per l'osservazione. In questo protocollo, il clustering stomatale è stato indotto nelle piantine A.thaliana. Le cellule di guardia raggruppate coltivate nel saccarosio contenenti mezzo con cloroplasti più grandi rispetto alle cellule di guardia coltivate in condizioni di esorose.
L'ingrandimento dei cloroplasti è stato confermato con un marcatore stroma cloroplasto e autofluorescenti alla clorofilla, suggerendo che il trattamento con saccarosio ha portato all'accumulo di cereali da amido nei cloroplasti. Inoltre, l'osservazione confocale della vasca-6 della GFP ha rivelato che i microtubuli corticali erano orientati radialmente nelle cellule trattate con saccarosio, proprio come nelle cellule di guardia senza saccarosio. In realtà abbiamo scoperto questo metodo per caso.
Dopo la scoperta, abbiamo esaminato la risposta ambientale degli stomi raggruppati. Riteniamo che il nostro sistema potrebbe contribuire ad esaminare l'importanza della distribuzione degli stomi.
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Panoramica
Questo protocollo illustra come indurre la formazione di stomi raggruppati nei cotiledoni di piantine di Arabidopsis thaliana utilizzando un mezzo contenente zucchero. Descrive inoltre l'osservazione di strutture intracellulari come cloroplasti e microtubuli nelle cellule di guardia mediante microscopia confocale a laser.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello Sviluppo delle Piante
- Funzione Stomatica
- Tecniche di Microscopia
Sfondo
- Gli stomi svolgono un ruolo cruciale negli scambi gassosi e nella regolazione dell'acqua nelle piante.
- La distribuzione spaziale degli stomi influenza la fisiologia e lo sviluppo della pianta.
- Arabidopsis thaliana è un organismo modello per lo studio della biologia vegetale.
- La microscopia laser confocale consente un'osservazione dettagliata delle strutture cellulari.
Scopo dello studio
- Indurre la formazione di stomati raggruppati in piantine di Arabidopsis thaliana.
- Studiare le strutture intracellulari delle cellule guardiane.
- Fornire un metodo applicabile a linee transgeniche o mutanti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un mezzo contenente zuccheri utilizzando sali di Murashige-Skoog e saccarosio.
- Regolazione del pH a 5,8 utilizzando idrossido di potassio.
- Trattamento per immersione dei germogli nel mezzo preparato.
- Osservazione delle cellule di guardia mediante microscopia laser confocale.
Risultati principali
- Induzione riuscita di stomati a gruppi nei cotiledoni.
- Visualizzazione dei cloroplasti e dei microtubuli nelle cellule di guardia.
- Dimostrata applicabilità a diverse linee di Arabidopsis.
- Forniti spunti sulla distribuzione spaziale degli stomati.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per lo studio dello sviluppo stomatico.
- Migliora la comprensione della funzione stomatica nelle piante.
- La ricerca futura può basarsi su questo protocollo per ottenere ulteriori approfondimenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la distribuzione spaziale degli stomi contribuisce a modellare in modo predittivo l'efficienza nell'uso dell'acqua e la capacità fotosintetica delle piante, aspetti rilevanti per l'ottimizzazione della resa delle colture e la resistenza allo stress in ambito di biotecnologie agricole. Questo sistema di induzione permette di analizzare meccanicamente la biologia delle cellule di guardia senza modificazioni genetiche, supportando la validazione di bersagli nelle vie di segnalazione vegetale. Il metodo fornisce una piattaforma scalabile e riproducibile per valutare gli effetti di composti sul patterning e sulla funzione stomatica nei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di patterning spaziale nello sviluppo degli stomi per convalidare bersagli nelle vie di segnalazione vegetale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema non genetico, inducibile chimicamente, applicabile a linee transgeniche o mutanti per la riduzione del rischio associato ai bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output fenotipici quantificabili (stomi clusterizzati, ingrandimento dei cloroplasti) per lo screening ad alto contenuto di composti bioattivi.
- Valore operativo: Utilizza un mezzo MS standardizzato con saccarosio e letture al microscopio confocale per garantire la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega il raggruppamento stomatiale a biomarcatori intracellulari (dimensione dei cloroplasti, orientamento dei microtubuli) per una riduzione del rischio meccanicistica negli studi sulla risposta allo stress nelle piante.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla scoperta di geni/target alla validazione fenotipica in sistemi rilevanti per le malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro iniziali della scoperta, in cui lo screening fenotipico e la validazione del bersaglio precedono l'identificazione del capostazione, in particolare nei processi di sviluppo di agrochimici e caratteri vegetali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'importanza del distanziamento stomatico mediante raggruppamento induttibile senza alterazione genetica.
- Screening: Permette sistemi pronti per saggi con fenotipi quantificabili delle cellule di guardia per lo screening di librerie di composti.
- Analisi: Fornisce letture quantitative al microscopio confocale (dimensione dei cloroplasti, orientamento dei microtubuli) per confrontare gli effetti dei trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Collega osservazioni intracellulari alla funzione stomatica per modelli predittivi nella risposta allo stress.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di induzione riutilizzabile applicabile a diverse linee di Arabidopsis mutanti e transgeniche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fiducia predittiva nella validazione del target tramite de-risking fenotipico dei meccanismi di patterning stomatoparistematico.
- Valore operativo: Standardizzazione mediante mezzo MS con saccarosio definito e regolazione del pH garantisce riproducibilità.
- Valore strategico: Consente decisioni precoci di tipo go/no-go sui composti che influenzano lo sviluppo stomatoparistematico, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei target aggiustata per il rischio, basata sulla validazione fenotipica in sistemi con stomati clusterizzati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella coltura di tessuti vegetali, nella tecnica asettica e nella microscopia confocale.
- È subordinato all'accesso ad autoclave, camere di crescita e microscopi a scansione laser.
- Necessita della standardizzazione della sterilizzazione dei semi e della preparazione del mezzo contenente saccarosio tra i diversi gruppi di lavoro.
- L'adattamento ad altre specie o tipi di tessuto potrebbe richiedere l'ottimizzazione della concentrazione di saccarosio e della durata di esposizione.
- È limitato ai fenotipi osservabili nei cotiledoni; l'estensione a saggi sull'intera pianta potrebbe richiedere ulteriori conferme sperimentali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
