Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Questo protocollo riproducibile e facile da eseguire utilizza una strategia di imaging dei linfonodi ex vivo per tracciare il drenaggio degli anticorpi fluorescenti etichettati fluorescenti somministrati in vivo agli organi linfoidi secondari locali. La dimostrazione di questa tecnica consente una visualizzazione specifica della procedura, che può facilitare un'esecuzione riuscita del protocollo. Questa è una tecnica molto semplice e diretta che può essere eseguita da chiunque.

L'unico aspetto impegnativo è la gestione del mouse, che richiede un po 'di allenamento. Questa tecnica ha il vantaggio di una migliore conservazione dello sforzo tissutale a velocità e della vitalità cellulare rispetto ai metodi di colorazione fluorescente convenzionali. Ad allenare la procedura sarebbe Bruna Tatematsu, una tecnico del laboratorio.

Diluire gli anticorpi di interesse, coniugati con i fluorofori appropriati, in 100 microlitri di PBS per l'imaging di linfonodi inguinali o 50 microlitri di PBS per l'imaging dei linfonodi poplitei. Per l'imaging dei linfonodi inguinali, caricare 100 microlitri del cocktail di anticorpi in una siringa per insulina millilitro, dotata di un ago da 30 gauge per mezzo pollice e iniettare sottocutaneamente gli anticorpi nella coscia interna del topo sperimentale. Per l'imaging dei linfonodi poplitei, iniettare 50 microlitri del cocktail di anticorpi per via sottocutanea in una zampa dell'animale sperimentale.

Quindi riportare l'animale nella sua scatola di casa. Per la raccolta del linfonodo drenante inguinale, dopo aver atteso almeno tre ore dall'iniezione, immobilizzare il mouse sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applicare olio minerale sulla pelle addominale. Utilizzare forbici di microchirurgia standard e forcette curve di microchirurgia per fare un'incisione della pelle mediana nell'addome dal pube al processo xifoide e dissociare la muscolatura addominale dalla pelle.

Effettuare incisioni cutanee orizzontali nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale, per creare lembi della pelle sul lato dell'iniezione e ritrarre la pelle per visualizzare il linfonodo. Fissare il lembo cutaneo alla piastra acrilica e utilizzare le forcep per rimuovere il linfonodo traslucido, di solito bilobulare sferico drenante inguinale. Per la raccolta dei linfonodi drenante poplitea, almeno 12 ore dopo l'iniezione, immobilizzare il topo in posizione prona su uno stadio acrilico.

Applicare olio minerale sul polpaccio e sul ginocchio sul lato iniettato dell'animale. Successivamente, fare un'incisione della linea mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio e dissociare la muscolatura del polpaccio dalla pelle. Esponi la fossa poplitea.

Il linfonodo popliteo apparirà come una sfera traslucida all'interno della fossa. Quindi, rimuovere il linfonodo con le forcep curve di microchirurgia. Per preparare il linfonodo per l'imaging, posizionare gli organi interi in un piatto di coltura di 35 per 10 millimetri con un fondo di vetro e utilizzare le forcelle per rimuovere qualsiasi grasso che circonda il tessuto.

Centrare l'organo al centro del piatto e coprire il tessuto con un pezzo di tergicristallo delicato intriso di salina. Per l'imaging ex vivo, posizionare il piatto nello slot del microscopio confocale invertito e utilizzare la luce convenzionale del microscopio confocale e l'obiettivo 4-10X per ottenere la messa a fuoco corretta. Passare dalla funzione di luce alla modalità laser e utilizzare un campione macchiato di isotopi, non macchiato o non fluorescente per regolare la potenza, l'offset e il guadagno laser per rimuovere la fluorescenza automatica e qualsiasi colorazione non specificata.

Acquisire immagini sotto gli obiettivi 4, 10 e 20X concentrandosi sulla struttura dei linfonodi e sulla distribuzione cellulare e utilizzando una definizione di 1024 per 1024 pixel. Quindi, utilizzare un programma software di analisi dell'imaging appropriato per separare i canali, aggiungere la scala e i colori di interesse e ricostruire la vista 3D. La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule linfonodo con anticorpi anti-CD4 e anti-CD19 e analisi di imaging confocale consente la localizzazione delle cellule T e B all'interno dei linfonodi inguinali.

Nei linfonodi poplitei, come nel tessuto inguinale, i follicoli cellulari B sono circondati da popolazioni di cellule T, un segno distintivo della struttura dei linfonodi. Come osservato in queste immagini, i fagociti non interiorizzano gli anticorpi iniettati, indicando che la colorazione delle cellule B e T è specifica. Inoltre, la ri-ricostruzione dell'etichettatura indica che la colorazione delle celle T e B non si sovrappone, confermando ulteriormente la specificità della colorazione.

Le cellule monocellulari si osservano in tutto il linfonodo inguinale, incluso il seno subcapsulare. Con la maggior parte delle cellule mononucleari che esprimono CX3XR1, seguite da cellule doppie positive CCR2 e CXCR31CCR2. Lo stesso modello di distribuzione cellulare e fenotipi cellulari si osserva nel linfonodo popliteo.

Entrambi i linfonodi mostrano anche regioni scure senza espressione del recettore delle cellule mononucleari occupate dai linfociti. Inoltre, le cellule mononucleari sono scarse all'interno dell'area interna dei linfonodi, rimanendo concentrate nelle aree esterne del tessuto, indicando che queste cellule occupano principalmente il seno subcapsulare del linfonodo. La miscela di anticorpi deve essere iniettata con precisione nel tessuto sottocutaneo affinché il sistema linfatico scarichi correttamente gli anticorpi sul linfonodo.

Questo metodo può essere applicato alla biodistribuzione di farmaci etichettati fluorescenti e agli studi di targeting cellulare di nanoparticelle etichettate fluorescenti.