Un modello preclinico di impatto corticale controllato per emorragia traumatica, contusione e neuroinfiammazione
10 giugno 2020
L'emorragia intraparenchimale e la neuroinfiammazione accompagnate da contusione cerebrale possono innescare gravi lesioni cerebrali secondarie. Questo protocollo descrive in dettaglio un modello di impatto corticale controllato (CCI) sui topi, che consente ai ricercatori di studiare l'emorragia, la contusione e le risposte immunitarie post-traumatiche ed esplorare potenziali terapie.
Questo modello può essere utilizzato per studiare le patologie associate alla contusione cerebrale, tra cui l'emorragia intracranica, la tossicità del ferro, la morte dei neuroni, il danno assonale, il deficit neurologico e l'infiammazione neurale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la gravità del danno cerebrale può essere facilmente controllata manipolando i parametri biochimici come la velocità e la morte dell'impatto sul dispositivo CCI. La lesione da frantumazione corticale focale indotta da CCI è altamente riproducibile.
Una corretta tecnica stereotassica e la procedura di craniotomia sono i principali fattori determinanti nella produzione di una lesione cerebrale indotta da CCI stabile e riproducibile. In generale, lo sperimentatore nuovo alla procedura avrà difficoltà a stabilizzare il topo sul telaio steriotexico e ad eseguire la craniotomia appropriata. A dimostrare la procedura sarà la signora Jhih Shuan Lin, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio.
Inizia confermando la mancanza di riflesso di pizzicamento dell'alluce nell'animale per assicurarti che sia adeguatamente anestetizzato. Radere la testa del topo con un tagliacapelli elettrico in direzione da caudale a rostrale. Ma non tagliare i baffi.
Posiziona il mouse sul telaio stereotassico e inserisci con cura le barre auricolari nei canali uditivi, assicurandoti che la testa del mouse sia stabilizzata da entrambe le barre auricolari allo stesso modo. Mantenere l'anestesia all'uno al 2% di isoflurano per tutta la durata dell'intervento chirurgico. Applicare vaselina su entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante l'intervento.
Quindi utilizzare tamponi di cotone sterili per disinfettare la testa rasata con betadina seguita da etanolo al 70%. Somministrare 100 microlitri di bupivacaina allo 0,25% per via sottocutanea con un ago da insulina calibro 31 e massaggiare delicatamente il sito di iniezione per un migliore assorbimento. Praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana del cuoio capelluto con un bisturi o delle forbici.
Quindi usa un emostatico per estrarre la pelle sul lato destro. Lasciare asciugare il cranio esposto per un minuto. Quindi pulire eventuali residui di sangue e tessuti sul cranio con un batuffolo di cotone sterile.
Verificare che la testa dell'animale sia a livello sul piano orizzontale e individuare i punti di riferimento anatomici, Bregma e Lambda, segnando entrambe le posizioni con una matita. Assicurarsi che la testa dell'animale sia a livello in direzione rostrale-caudale misurando le coordinate Z sia di Bregma che di Lambda. Utilizzare la stessa procedura per posizionare orizzontalmente la testa.
Utilizzare un ago da insulina calibro 31 per identificare il sito della craniectomia. Imposta l'origine XY su Bregma e sposta lateralmente l'ago di tre millimetri a destra. Segna questa posizione come sito di craniectomia e disegna un cerchio di quattro millimetri di diametro sul cranio con una matita.
Tagliare lungo il cerchio delineato a matita con un micro trapano ad alta velocità con la trepina per creare un foro aperto di quattro millimetri di diametro. Rimuovere il lembo osseo con una pinzetta e conservarlo in soluzione salina normale ghiacciata. Sciacquare delicatamente il foro con soluzione fisiologica prima di applicare pressione sulla superficie del cervello per fermare l'emorragia.
Sul dispositivo CCI, impostare la punta arrotondata dell'impattatore di 2,5 millimetri di diametro su un angolo di 22,5 gradi. Azzerare la punta dell'impatto sulla superficie durale e impostare i parametri di impatto sulla scatola di controllo su una velocità di quattro metri al secondo e una profondità di deformazione di due millimetri. Ritrarre la punta metallica.
Scaricare il pistone per generare un impatto sul cervello. Quindi posizionare un batuffolo di cotone sterile sulla zona lesa per fermare l'emorragia. Sostituire il lembo osseo e fissarlo con cemento dentale.
Chiudere il cuoio capelluto con un adesivo per tessuti. Posiziona il mouse sotto la lampada riscaldante in una gabbia di recupero pulita con lettiera fino al completo recupero. Una corretta tecnica stereotassica e la procedura di craniectomia sono i principali determinanti nella produzione di lesioni cerebrali indotte da CCI stabili e riproducibili.
Una procedura di craniectomia ideale causerebbe una lesione istologica minima nel cervello finto. Cambiamenti nel danno cerebrale e nella perdita del corpo calloso sono stati osservati ai giorni 1, 3, 7 e 28 dopo la CCI. Inoltre, l'atrofia cerebrale unilaterale sul lato della contusione è stata osservata il giorno 28 dopo la CCI.
La neuroinfiammazione è stata rivelata dall'attivazione della microglia Iba1-positiva e dall'accumulo di macrofagi attorno al bordo dell'area della contusione. L'emorragia intraparenchimale è stata rilevabile anche dalla colorazione Ly76-positiva dal primo al settimo giorno dopo la CCI. Una miscela di globuli rossi con morfologia cellulare rotta e intatta è stata osservata al settimo giorno dopo la CCI, suggerendo che i globuli rossi sono stati lisati in questa fase.
Questo fenomeno era coerente con l'osservazione che la deposizione di ferro ferrico era rilevabile nella regione della contusione dal settimo al 28° giorno dopo la CCI. Microglia e macrofagi attivati sono stati osservati nello striato lontano dal sito della contusione dal terzo al 28° giorno dopo la CCI, indicando lesioni del corpo calloso e dello striatale. Questa tecnica apre la strada allo sperimentatore per esplorare ulteriormente l'interazione della neuroinfiammazione indotta dall'emorragia cerebrale attraverso la comprensione della risposta delle cellule immunitarie, come la microglia, dopo la contusione dell'emorragia.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un modello murino di impatto corticale controllato (CCI) che consente ai ricercatori di studiare la contusione emorragica e le risposte immunitarie post-traumatiche. Il modello può essere utilizzato per indagare le patologie associate alla contusione cerebrale, inclusi emorragia intracranica e neuroinfiammazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neuroinfiammazione
- Lesione cerebrale traumatica
Sfondo
- L'ematoma intraparenchimale e la neuroinfiammazione possono indurre un danno cerebrale secondario grave.
- Il modello di lesione cerebrale controllata (CCI) consente lo studio controllato della gravità del danno cerebrale.
- Una corretta tecnica stereotassica e la craniotomia sono fondamentali per la riproducibilità.
- Per i nuovi ricercatori esistono difficoltà nel stabilizzare il topo e nell'eseguire la craniotomia.
Scopo dello studio
- Esplorare potenziali terapie per lesioni cerebrali.
- Comprendere le risposte immunitarie successive a un trauma cranico.
- Studiare gli effetti di parametri d'impatto variabili sui danni cerebrali.
Metodi Utilizzati
- Modello di impatto corticale controllato (CCI) nei topi.
- Manipolazione di parametri biochimici come la velocità.
- Utilizzo di telai stereotassici per un posizionamento preciso.
- Procedure di craniotomia per accedere al cervello.
Risultati principali
- Riproducibilità del danno corticale focale indotto da CCI.
- Impatto di diverse velocità sulla gravità del danno cerebrale.
- Informazioni sulle risposte immunitarie post-traumatiche.
- Dimostrazione della procedura da parte dell'assistente di laboratorio Sig.ra Jhih Shuan Lin.
Conclusioni
- Il modello CCI è efficace per lo studio del trauma cranico.
- Parametri controllati permettono l'analisi di diverse gravità delle lesioni.
- Ulteriori ricerche possono portare a possibili sviluppi terapeutici.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello preclinico permette l'induzione controllata di contusione cerebrale focale nei topi, supportando l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio associato ai percorsi di neuroinfiammazione legati all'emorragia. Fornisce un sistema riproducibile per valutare interventi terapeutici mirati alle risposte immunitarie post-traumatiche e al danno cerebrale secondario. Il modello contribuisce alla validazione degli obiettivi terapeutici e al rafforzamento della previsione nell'ambito dei programmi per le malattie neurodegenerative e per le lesioni cerebrali traumatiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di neuroinfiammazione indotta da emorragia mediante impatto corticale controllato.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli coinvolti nelle vie di attivazione delle microglia/macrofagi e di tossicità del ferro.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione dell'effetto della modulazione di bersagli sui risultati relativi alla progressione della contusione e ai deficit neurologici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera parametri quantificabili di patologia, inclusi microglia positivi per Iba1, colorazione positiva per Ly6B e deposito di ferro ferrico.
- Valore operativo: Consente una gravità della lesione altamente riproducibile grazie a parametri controllabili di velocità e profondità di deformazione.
- Prontezza del saggio: Permette lo screening standardizzato di composti mirati a endpoint di emorragia, contusione e neuroinfiammazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la progressione rilevante per la malattia, dal contusione acuta alla neurodegenerazione cronica, inclusi danno assonale e atrofia cerebrale.
- Valore operativo: Consente la valutazione longitudinale dei deficit neurocomportamentali e della patologia ai giorni 1, 3, 7 e 28 dopo la lesione.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica di terapie mirate alle interazioni neuroimmunitarie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, consentendo una riduzione iterativa dei rischi associati ai meccanismi neuroinfiammatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle risposte delle cellule immunitarie in seguito a emorragia intracerebrale e formazione di contusioni.
- Screening: Fornisce condizioni pronte all'uso per valutare gli effetti di composti sull'attivazione della microglia e sulla tossicità mediata dal ferro.
- Analisi: Fornisce variabili quantitative dipendenti, tra cui volume della lesione, espressione di marcatori specifici per cellula e punteggio neurologico.
- Ricerca traslazionale: Permette un percorso continuo dal chiarimento dei meccanismi all'validazione preclinica di interventi modificanti la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione trasversale ai programmi di modelli di emorragia-contusione in diverse aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'interazione tra emorragia e neuroinfiammazione grazie a parametri di lesione controllabili.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante procedure stereotassiche e craniotomiche standardizzate, minimizzando la variabilità tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo una previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio in contesti fisiopatologici rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base al rischio, considerando i loro effetti sull'evoluzione della contusione e sulle cascate neuroinfiammatorie.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica e tecniche di craniotomia per un'induzione lesiva costante.
- Dipende da strumentazione di precisione, inclusi impattori pneumatici e telaio stereotassico, per il controllo dei parametri.
- Necessita di protocolli standardizzati di istologia e valutazione comportamentale per garantire la comparabilità tra studi.
- Comporta considerazioni di adattamento nella traduzione dei parametri tra diverse linee di topi o modelli di lesione.
- È limitato dalla necessità di un'adeguata sorveglianza postoperatoria e di infrastrutture per il recupero, al fine di assicurare il benessere animale e l'integrità dei dati.
