Replica biomimetica della microstruttura superficiale della radice mediante alterazione della litografia morbida
5 agosto 2020
La biomimetica è stata precedentemente utilizzata come strumento per studiare le interazioni foglia-microrganismo. Tuttavia, tale strumento non esiste per le radici. Qui, sviluppiamo un protocollo per formare superfici sintetiche che imitano la microstruttura della superficie della radice per lo studio delle interazioni radice-ambiente.
Questo protocollo consente di sviluppare un sistema sintetico che imita la microstruttura della superficie della radice. Il sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni radice-ambiente in modo di controllo con enfasi sulla struttura della superficie. Questa è una tecnica semplice che può essere eseguita in qualsiasi laboratorio che studia le interazioni radice-ambiente.
Inoltre, questa tecnica consente la formazione della superficie da vari materiali. Il passo più difficile è la rimozione della radice naturale dallo stampo negativo. Questo passaggio richiede una manipolazione delicata della radice per evitare di strappare i peli della radice.
La dimostrazione visiva migliorerà la capacità del visualizzatore di replicare questa procedura. Inizia rimuovendo la pianta dal terreno dopo tre settimane di crescita. Tagliare il sistema radicale dalla pianta nel punto di interazione con il gambo e mettere la pianta senza radici in un becher con acqua.
Dopo alcuni giorni, tagliare le radici avv accidentali che emergono dal gambo e usarle per la replicazione. Per preparare radici germinate di semi, bagnare una carta da filtro all'interno di una piastra di Petri con acqua e mettere diversi semi M82 sulla carta. Incubare il piatto a 25 gradi Celsius e idratare la carta ogni giorno.
Circa cinque giorni dopo, le radici germinanti saranno abbastanza lunghe da essere utilizzate per la replicazione. Preparare la soluzione di replica negativa aggiungendo 9,49 grammi di dimetariolato diuretano a una tazza da 50 millilitri. Aggiungere 1,45 millilitri di metacrilato etilico alla tazza e conservare a temperatura ambiente fino a quando la soluzione diventa omogenea e sembra chiara.
Aggiungere tre millilitri del plastificante e mescolare la soluzione per un'altra ora. Quindi aggiungere 300 microlitri dell'iniziatore fotografico e mescolare durante la notte o fino a quando tutte le bolle non vengono rimosse. Per generare la replica negativa della radice, prendere uno scivolo di vetro pulito e versare un millilitro della soluzione di replica negativa su di esso.
Posizionare da due a tre radici sulla soluzione, assicurandosi che le radici non siano completamente coperte. Tenere lo scivolo sotto una lampada ultravioletta da otto watt per otto-10 minuti, quindi spegnere la lampada UV. Rimuovere la replica dallo scivolo di vetro e metterla in una piastra di Petri piena di etanolo per rimuovere il monomero non redatto.
Utilizzare le forcep per rimuovere lentamente e delicatamente la radice dalla replica. Per preparare la soluzione PDMS per la replica positiva, mettere 10 grammi di dimetil siloxano in una tazza. Aggiungere un grammo di agente polimerizzante e mescolare accuratamente.
Scaldare la miscela in un essiccatore sotto vuoto per due ore per rimuovere le bolle d'aria. Posizionare la replica negativa in poliuretano in una piastra di Petri e versare la miscela PDMS sopra la replica negativa. Applicare il vuoto per due ore per garantire la copertura della microstruttura e mantenere la piastra di Petri a temperatura ambiente durante la notte.
Il giorno successivo, separare la replica positiva curata dalla replica negativa utilizzando le forcep. Per preparare la replica positiva dalla cellulosa etilica, aggiungere 20 millilitri di etanolo a una tazza da 100 millilitri. Quindi aggiungere 1,32 millilitri di plastificante e 3,3 grammi di cellulosa etile.
E mescolare la soluzione a temperatura ambiente per due ore. Il giorno successivo, versare la soluzione di cellulosa etile sopra la replica negativa in una piastra di Petri e lasciare il piatto sotto il cappuccio durante la notte. Quindi rimuovere lentamente la replica positiva dalla replica negativa con forcep.
È possibile generare una buona replica negativa se il protocollo viene seguito correttamente. Questa replica mostrerà la struttura cellulare della superficie della radice e i fori che rappresentano la posizione dei peli della radice. Se la radice è immersa nella soluzione di poliuretano, diventerà intrappolata nel polimero duro e rimarrà all'interno della replica negativa dopo che è stata curata.
Quando si polimerizza con la luce UV, superando il tempo di polimerizzazione consigliato, si oserà uno stampo in poliuretano estremamente duro, rendendo impossibile rimuovere la radice senza romperla. A volte i pezzi di radice sono così piccoli che è necessaria la microscopia per vederli. Repliche positive sono state generate con PDMS ed etile cellulosa.
I peli delle radici si trovano nella zona di allungamento dove iniziano ad emergere. Le loro lunghezze variano lungo la superficie della radice man mano che diventano più lunghe, simili alla radice naturale. Alcuni dei peli sulla replica della cellulosa etile sono visibili anche al microscopio leggero.
Quando si posiziona la radice sulla soluzione di replica negativa, è importante scegliere il lato destro ed evitare l'immersione della radice all'interno della soluzione. Questa tecnica è stata sviluppata per fornire una nuova via per la ricerca delle interazioni con l'ambiente di superficie radicale. In particolare, le forze fisiche causate dalla microstruttura e dalle proprietà del materiale della superficie.
Panoramica
Questo protocollo consente lo sviluppo di superfici sintetiche che imitano la microstruttura della superficie radicale, facilitando studi controllati sulle interazioni tra radice e ambiente. La tecnica è semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio specializzato nello studio delle radici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomimetica
- Biologia vegetale
- Microstruttura radicale
Sfondo
- Studi precedenti hanno utilizzato la biomimetica per le interazioni foglia-microorganismo.
- Non erano disponibili strumenti esistenti per lo studio delle interazioni radice.
- Questo studio colma la lacuna creando superfici radicali sintetiche.
- Il protocollo sottolinea l'importanza della struttura superficiale negli studi sull'interazione radice-ambiente.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema sintetico che imiti la microstruttura della superficie radicale.
- Permettere studi controllati sulle interazioni tra radice e ambiente.
- Fornire una tecnica riproducibile per i ricercatori in biologia vegetale.
Metodi Utilizzati
- Estrazione delle radici dalle piante e preparazione di calchi negativi.
- Utilizzo di diuretano dimetacrilato e metacrilato di etile per la creazione di repliche negative.
- Preparazione di repliche positive utilizzando PDMS e etilcellulosa.
- Dimostrazioni visive per facilitare la riproduzione della procedura.
Risultati principali
- Generazione con successo di repliche negative e positive delle superfici radicali.
- Le repliche rappresentano accuratamente la struttura cellulare e la posizione dei peli radicali.
- Dimostrata la fattibilità dell'uso di diversi materiali per la replicazione delle superfici.
- Forniti spunti sulle forze fisiche che influenzano le interazioni tra radice e ambiente.
Conclusioni
- Questa tecnica apre nuove prospettive per la ricerca sulle interazioni della superficie radicale.
- Permette studi dettagliati degli effetti della microstruttura sul comportamento radicale.
- La ricerca futura potrà basarsi su questo protocollo per esplorare diversi fattori ambientali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa piattaforma biomimetica consente un'indagine controllata degli effetti della microstruttura della superficie radicale sulle interazioni microbiche, affrontando una lacuna fondamentale nella ricerca sulle interazioni pianta-microbo. Riproducendo architetture di peli radicali delicate in materiali sintetici, il metodo supporta l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio associato a ipotesi riguardanti processi biologici mediati dalla superficie. L'approccio fornisce un sistema scalabile e riutilizzabile per valutare in che modo le caratteristiche fisiche della superficie influenzano la colonizzazione microbica e la secrezione enzimatica nei flussi di lavoro di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle relazioni struttura-funzione nelle interazioni radice-microbo isolando la topografia superficiale come variabile indipendente.
- Valore operativo: Fornisce superfici sintetiche riproducibili per testare in modo coerente le ipotesi attraverso replicati sperimentali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera modelli microstrutturali quantificabili per la valutazione standardizzata dell'adesione microbica e dell'attività enzimatica.
- Valore operativo: Consente la versatilità dei materiali (PDMS, etilcellulosa) per modulare le proprietà della superficie in base a specifici obiettivi di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette il tracciamento della localizzazione dei microorganismi rispetto a caratteristiche superficiali definite, consentendo la correlazione tra microstruttura e risultati funzionali come la secrezione di cellulasi.
- Valore operativo: Offre un'opzione in grado di degradarsi a base di etilcellulosa per modellare cambiamenti superficiali dinamici negli studi preclinici di sfida microbica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si colloca nella fase di scoperta biologica, consentendo la generazione di ipotesi sui comportamenti microbici mediati dalla superficie prima di avviare attività di screening dei composti o di ottimizzazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo una variazione sistematica della densità dei peli radicali e delle caratteristiche della zona di allungamento per testarne l'influenza sul comportamento microbico.
- Screening: Produce superfici standardizzate e riproducibili per una valutazione ad alta fedeltà delle interazioni microbiche in condizioni superficiali controllate.
- Analisi: Permette la mappatura spaziale della posizione dei microorganismi rispetto alla microstruttura superficiale, fornendo letture quantitative basate su immagini per studi sulle interazioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l'analisi della microstruttura nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso superfici biomimetiche che riflettono l'architettura naturale della radice.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una tecnologia di piattaforma applicabile a molteplici specie vegetali e sistemi microbici, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulle interazioni radice-microbo separando la struttura superficiale dalle variabili chimiche e biologiche.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di stampaggio e replicazione, compatibili con l'equipaggiamento di laboratorio comune.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo modelli predittivi delle superfici che riducono la dipendenza da campioni naturali variabili.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target microbici o dei composti basata sui profili d'interazione dipendenti dalla struttura, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel trattamento dei tessuti vegetali e nelle tecniche di litografia morbida per la corretta generazione dello stampo.
- Necessita di attrezzature per la polimerizzazione UV e di un desiccante sotto vuoto per la produzione di repliche prive di bolle.
- Richiede protocolli standardizzati di preparazione delle radici per garantire un'acquisizione coerente delle microstrutture tra diversi lotti.
- Comporta compromessi nella scelta del materiale tra la durabilità del PDMS e la biodegradabilità dell'etilcellulosa, a seconda degli obiettivi dello studio.
- È limitato dalla necessità di un'estrazione delicata delle radici per preservare le strutture fini dei peli radicali durante la creazione dello stampo negativo.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
