Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo
6 novembre 2021
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.
Ciao, e benvenuto in questo video di JoVE. Vogliamo presentarvi la configurazione che abbiamo qui per la creazione rapida della griglia, uno studio risolto nel tempo che stiamo sviluppando a Leeds. Tieni presente che questo non è un sistema standard, ma speriamo che dandoti un resoconto dettagliato di tutte le cose e dei parametri che facciamo, sarai in grado di sviluppare sistemi simili nei tuoi laboratori.
Una descrizione dettagliata del dispositivo è fornita nel protocollo Richmond. Qui, forniremo una guida passo-passo per la preparazione rapida della griglia e l'EM risolta nel tempo. Nella nostra esperienza, la concentrazione di proteine dovrebbe essere di due milligrammi per millilitro o superiore. Il protocollo richiede un volume minimo di circa 50 microlitri.
Accendi il dispositivo. Quindi accendere il PC di controllo e avviare il software di controllo. Inizializzare tutte le pompe a siringa premendo il pulsante di inizializzazione su ciascuna pompa a siringa.
Accendere l'alimentatore del potenziometro, impostarlo su nove volt e avviare il software di controllo dell'oscilloscopio. Il gas azoto pressurizzato è necessario per generare lo spray. Aprire il cilindro di azoto e impostare la pressione su 2 bar.
Assicurarsi che tutte le valvole della pompa a siringa siano in posizione di carico. Per fare ciò, commutare tutte le valvole per erogare nel software di controllo e quindi tornare a caricare. Impostare tutte le siringhe a zero.
Eventuali bolle d'aria presenti nel sistema devono essere rimosse in questa fase. Per fare ciò le siringhe potrebbero dover essere svitate, le bolle rimosse manualmente e le siringhe montate di nuovo quando non contengono più bolle. Il sistema di gestione dei liquidi viene solitamente immagazzinato in acqua.
Prima di caricare il campione, il sistema viene bilanciato con il buffer. Questo viene fatto lavando il tubo con un eccesso di buffer. Posizionare un tubo contenente almeno 200 microlitri di tampone su una siringa.
La parte superiore del tubo deve essere forata per fissarlo. Aspirare una quantità adeguata di tampone, tra 50 e un centinaio di microlitri con siringa uno utilizzando il software di controllo. Interruttore valvola uno per erogare.
Erogare tutto il liquido in una siringa uno. Riportare la valvola uno alla posizione di carico e premere il pulsante di inizializzazione sulla siringa uno per preparare il sistema per il ciclo di lavaggio successivo. Questi passaggi vengono solitamente ripetuti tre volte per garantire un lavaggio accurato del tubo.
Successivamente, viene posizionato l'ugello di spruzzatura. Posizionare una griglia EM nel braccio di immersione. Posizionare la griglia davanti all'ugello di spruzzatura.
Erogare il buffer utilizzando il software di controllo. Se l'ugello e la griglia sono allineati, il liquido dovrebbe accumularsi dopo la spruzzatura per un lungo periodo di tempo. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello e quindi controllare nuovamente dove il liquido si accumula sulla griglia.
Quindi, regolare la posizione della tazza di etano. La punta delle pinzette dovrebbe raggiungere approssimativamente il centro della tazza di etano. Eseguire un'esecuzione di test per assicurarsi che tutte le impostazioni siano corrette.
Chiudere la camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro. Aspirare il volume di tampone necessario per una singola corsa in una siringa.
Interruttore valvola uno per erogare. Avviare la corsa premendo run'in nel software di controllo. Controllare che la pompa della siringa uno si muova, due secondi in questo caso, e che la griglia sia immersa dopo un ritardo appropriato, 1,5 secondi qui.
Al termine della corsa, impostare la pressione sul braccio dello stantuffo sul valore desiderato. Premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Ora la tazza di etano è fresca e piena di etano liquido.
Glow-scarica le griglie prima dell'uso. Una tipica scarica di bagliore è di 90 secondi a 10 milliampere in 0,1 millibar di aria. Il tubo viene quindi bilanciato con il campione.
Se il volume del campione disponibile è basso, il tubo può essere bilanciato con un solo volume morto. Aspirare il campione. In genere il volume morto è di circa 30 microlitri.
Interruttore valvola uno per erogare. Erogare il campione attraverso tubi e ugelli. Quindi aspirare la quantità di campione necessaria per una singola esecuzione.
Interruttore valvola uno per erogare. Verificare che l'umidità relativa abbia raggiunto il valore desiderato. In genere prepariamo le griglie al 60% o superiore.
Questa lattina può richiedere alcuni minuti. Posizionare le pinzette tenendo una griglia a scarica luminosa nel braccio di immersione. Posizionare la slitta del potenziometro nella posizione di partenza, pronta per la misurazione della velocità.
Impostare il trigger per la misurazione della velocità nel software dell'oscilloscopio. Posizionare la tazza di etano liquido e vicino alla camera di umidità. Assicurarsi che il percorso dello stantuffo sia chiaro.
Avviare l'esecuzione nel software di controllo. Al termine della corsa, premere OK'in nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Aprire la camera di umidità, allentare la connessione tra braccio tuffante e pinzette.
Spostare verso l'alto il braccio di immersione mantenendo la griglia in etano liquido. Quindi trasferire le griglie all'azoto liquido e allo stoccaggio. Salvare la misurazione dell'oscilloscopio.
Reimpostare manualmente la posizione del cursore del potenziometro e dello stantuffo. Ripetere il protocollo per preparare le griglie di replica. Gli esperimenti risolti nel tempo vengono eseguiti in modo simile.
Sono necessarie concentrazioni di stock più elevate per gli esperimenti risolti nel tempo a causa della diluizione nella fase di miscelazione. Per un esperimento risolto nel tempo, utilizzare tutte e tre le siringhe. Il tubo è fissato alle pompe a siringa e all'ugello di spruzzatura.
L'ugello di spruzzatura microfluidica utilizzato qui contiene anche un elemento di miscelazione. Si noti che i tubi più lunghi daranno un volume morto maggiore e le fasi di bilanciamento del lavaggio richiedono più tampone e campione. Equilibrare tutte le siringhe con tampone e campione separatamente.
Tipicamente, la siringa uno viene utilizzata per il campione A e le siringhe due e tre vengono utilizzate per il campione B'Dopo che il tubo è stato equilibrato, caricare il campione A nella siringa uno e il campione B nelle siringhe due e tre. Quindi, passare le valvole da una a tre per erogare. Avviare l'esecuzione nel software di controllo.
Si noti che è necessario uno script di esecuzione diverso per un esperimento risolto nel tempo. Ritardi diversi possono essere raggiunti in due modi. Regolando la velocità dello stantuffo, è possibile modificare il ritardo temporale dalla miscelazione al congelamento.
Una maggiore velocità di immersione porterà a un ritardo temporale più breve. In alternativa, la distanza dell'etano di spruzzatura viene modificata regolando la posizione verticale dell'ugello di spruzzatura. L'aumento della distanza comporterà un ritardo temporale più lungo.
Nel microscopio elettronico a basso ingrandimento, una griglia tipica assomiglia a questa. Le aree di ghiaccio sottile, come indicato, sono adatte per l'acquisizione dei dati. A ingrandimenti più elevati, le particelle dovrebbero essere chiaramente visibili.
Con un campione di prova come l'apoferrittina, un set di dati relativamente piccolo da una singola griglia è sufficiente per una ricostruzione con una risoluzione di tre o quattro angstrom. Per gli esperimenti risolti nel tempo, raccogliamo set di dati da diversi punti temporali o griglie. È utile combinare i dati per la classificazione 3D e quindi tracciare le particelle fino ai loro punti temporali.
In questo modo i dati possono fornire informazioni strutturali e informazioni sulla cinetica di reazione. In conclusione, speriamo che il video ti sia piaciuto. Speriamo che con le descrizioni dettagliate nel documento JoVE insieme al video, sarai in grado di condurre i tuoi esperimenti tramite la creazione rapida della griglia, che ha dimostrato di alleviare alcuni dei problemi derivanti dalla mutazione o di aiutare con le interazioni all'interfaccia aria-acqua, tutto ciò di cui hai bisogno per condurre i tuoi studi risolti nel tempo per cercare di intrappolare alcuni di quegli stati di non equilibrio.
Quindi, felice creazione della griglia.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la preparazione rapida di griglie in microscopia elettronica criogenica (cryo-EM), con un focus sia sulla preparazione standard rapida delle griglie sia su esperimenti risolti nel tempo. Il metodo descritto utilizza un dispositivo personalizzato realizzato in laboratorio che permette la preparazione delle griglie in pochi millisecondi, facilitando la cattura di stati intermedi di breve durata nelle reazioni proteiche. Il protocollo è stato progettato per essere accessibile ai ricercatori che intendono sviluppare sistemi simili o condurre studi di cryo-EM risolti nel tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Microscopia elettronica criogenica (cryo-EM)
- Biologia strutturale
- Tecnologia di preparazione del campione
Sfondo
- La microscopia crioelettronica (Cryo-EM) sta progredendo rapidamente grazie a miglioramenti nell'hardware e negli algoritmi di elaborazione dei dati.
- I metodi tradizionali di preparazione del campione, come il blotting, stanno venendo sostituiti da tecniche più rapide come il dosaggio piezoelettrico, la stampa con puntina e la spruzzatura diretta.
- Una preparazione rapida delle griglie è essenziale per la cryo-EM risolta nel tempo, permettendo lo studio di stati molecolari transitori.
- Le sfide includono il controllo dello spessore del ghiaccio e l'ottimizzazione dell'uso del campione.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo passo dopo passo per la preparazione rapida e risolta nel tempo di griglie per microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) mediante l'uso di un dispositivo personalizzato.
- Permettere ai ricercatori di replicare o adattare il metodo per i propri laboratori.
- Facilitare lo studio di reazioni biochimiche rapide intrappolando stati intermedi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione e inizializzazione di un dispositivo personalizzato per la rapida preparazione di griglie, dotato di pompe a siringa e di un ugello microfluidico per nebulizzazione.
- Equilibrazione del sistema con tampone e rimozione delle bolle d'aria dai tubicini.
- Trattamento con scarica al plasma delle griglie per microscopia elettronica prima dell'applicazione del campione.
- Allineamento preciso dell'ugello di nebulizzazione, della griglia e della coppa di etano per una congelazione ottimale.
- Controllo automatizzato dell'erogazione del campione, della nebulizzazione e dell'immersione nell'etano liquido.
- Esecuzione di esperimenti risolti nel tempo mediante l'uso di più siringhe per la rapida miscelazione dei reagenti prima del congelamento.
- Regolazione dei ritardi temporali attraverso la velocità del pistone e la posizione dell'ugello.
Risultati principali
- La preparazione delle griglie può essere effettuata con soli 50 µL di campione a concentrazioni ≥2 mg/mL per quattro griglie.
- L'intervallo tra l'applicazione del campione e il congelamento può essere breve fino a 10 ms.
- Esperimenti risolti nel tempo permettono di catturare intermedi reattivi variando i ritardi tra mescolamento e congelamento.
- Le griglie ottenute sono adatte alla raccolta di dati ad alta risoluzione, con campioni di prova che forniscono ricostruzioni a una risoluzione di 3–4 Å.
Conclusioni
- Il protocollo consente una preparazione rapida e riproducibile delle griglie per microscopia crioelettronica, supportando sia studi standard che risolti nel tempo.
- I ricercatori possono adattare la configurazione descritta per sviluppare dispositivi personalizzati per la produzione rapida di griglie.
- Questo approccio apre nuove opportunità per lo studio di processi biologici dinamici con elevata risoluzione temporale e spaziale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione rapida della griglia per la microscopia elettronica criogenica consente di catturare stati molecolari transitori, influenzando direttamente la fase iniziale della scoperta e la riduzione del rischio meccanicistico nella ricerca biofarmaceutica&D. Riducendo il tempo tra il mescolamento del campione e il congelamento fino a soli 10 ms, questo approccio consente analisi strutturali ad alta risoluzione di intermedi a vita breve, fornendo informazioni utili per la validazione degli obiettivi terapeutici e l'identificazione di composti guida. La riproducibilità e l'adattabilità del protocollo lo posizionano come una capacità scalabile per i flussi di scoperta aziendali.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di conformazioni proteiche dinamiche e di intermedi di reazione.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando stati strutturali transitori rilevanti per la funzione.
- Facilita una previsione affidabile dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
Screening e sviluppo di saggi
- Prepara griglie di microscopia crioelettronica validate adatte per lo screening strutturale ad alto rendimento.
- Fornisce output riproducibili e quantitativi per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Consente una valutazione rapida dei cambiamenti strutturali indotti da composti nelle proteine.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea istantanee strutturali con meccanismi rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Permette un avanzamento adeguato al rischio fornendo dati ad alta risoluzione sugli stati funzionali.
- Consente l'integrazione di informazioni strutturali nella selezione dei modelli preclinici e nelle strategie di biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo rapido di preparazione della griglia è adatto dalle prime fasi della scoperta fino all'identificazione del composto attivo, supportando flussi di lavoro basati su ipotesi e su screening in biologia strutturale.
- Biologia della scoperta: Accelera la verifica delle ipotesi catturando stati fuori equilibrio per una chiarezza meccanicistica.
- Screening: Fornisce griglie standardizzate e riproducibili per l'analisi crioelettronica e la valutazione di composti in fasi successive.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa di cambiamenti strutturali e della cinetica delle reazioni in diversi punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mettendo in relazione intermedi strutturali e risultati funzionali.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo modulare e adattabile per diversi sistemi proteici e progettazioni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione della griglia, migliorando la riproducibilità e la scalabilità tra i diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento o interruzione fornendo dati strutturali ad alta risoluzione e risolti nel tempo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di bersagli validati strutturalmente, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'uso di strumentazione per microscopia crioelettronica e nella manipolazione dei campioni.
- Necessita dell'accesso a sistemi di dispensazione microfluidici, controlli temporali precisi e infrastrutture criogeniche.
- Richiede una standardizzazione tra diversi gruppi di lavoro per garantire una qualità riproducibile delle griglie e la comparabilità dei dati.
- È adattabile a diversi sistemi proteici, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione in base alla concentrazione del campione e allo spessore del ghiaccio.
- Uno spessore maggiore del ghiaccio a velocità più elevate potrebbe limitare la qualità dei dati in alcune applicazioni.
