Uso di Crystal Violet per migliorare la lettura basata sull'effetto citopatico visivo per la titolazione virale utilizzando i saggi TCID50
12 febbraio 2022
Questo protocollo mostra un approccio accurato e oggettivo per visualizzare le titolazioni virali utilizzando il viola cristallino, confrontandolo con la microscopia ottica e la colorazione immunocitochimica.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di produrre una titolazione delle scorte di virus e visualizzarla utilizzando la colorazione viola cristallina. Per fare ciò, verrà dimostrata una titolazione virale generale seguita dalla colorazione. Questa titolazione sarà eseguita in una piastra da 96 pozzetti per un periodo di sette giorni in un armadio di biosicurezza all'interno di un laboratorio di livello di biosicurezza 2.
Per fare ciò, una piastra a 96 pozzetti della linea cellulare preferita verrà seminata utilizzando il mezzo corrispondente e lasciata crescere fino alla confluenza. Lo stock di virus sarà diluito utilizzando dieci diluizioni, mescolando 900 microlitri di media e 100 microlitri di virus, o la corrispondente diluizione. Assicurarsi di ruotare ogni tubo per garantire una corretta miscelazione del fluido e del virus ed evitare errori sulle diluizioni.
Scrivi il layout della tua piastra in testa e ogni diluizione per aiutare durante il processo di infezione. Prima dell'infezione, lavare con 200 microlitri di PBS. Aggiungi 50 microlitri del tuo inoculo nei pozzetti corrispondenti.
Quindi, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 al 5% per sette giorni. Dopo l'incubazione di sette giorni, lavare con 200 microlitri di PBS. Fissare le cellule aggiungendo 50 microlitri per pozzetto di PFA al 4% in PBS e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, lavare nuovamente le cellule due volte con 200 microlitri di PBS prima dell'aggiunta di 50 microlitri per pozzetto di viola cristallino in acqua e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Infine, aspirare il cristallo viola dai pozzetti e, facoltativamente, lasciare asciugare le piastre all'aria per due-cinque minuti a temperatura ambiente o lavarlo con 200 microlitri d'acqua per rimuovere le macchie eccessive prima della visualizzazione. Di conseguenza, dopo la ricolorazione, le cellule negative saranno macchiate.
I pozzi positivi saranno eliminati. Queste informazioni verranno utilizzate in una delle due formule descritte per calcolare il titolo virale finale. Quando il titolo ottenuto con ciascun metodo è stato confrontato, ha dimostrato che nella chimica monocyto la colorazione potrebbe in alcuni casi rilevare ulteriori pozzetti positivi rispetto al viola cristallino e che, allo stesso modo, entrambi i metodi di colorazione potrebbero rilevare più pozzi positivi rispetto alla valutazione visiva tramite microscopia.
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Panoramica
Questo protocollo illustra un metodo accurato per la visualizzazione delle titolazioni virali mediante colorazione con violetto di cristallo. Tale metodo viene confrontato con la microscopia ottica e la colorazione immunocitochimica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Biologia cellulare
- Tecniche di laboratorio
Sfondo
- La titolazione virale è essenziale per quantificare le scorte di virus.
- La colorazione con violetto cristallino fornisce una rappresentazione visiva della presenza virale.
- I metodi comparativi includono la microscopia ottica e la colorazione immunocitochimica.
- Le tecniche corrette di diluizione sono fondamentali per ottenere risultati accurati.
Scopo dello studio
- Produrre una titolazione del ceppo virale.
- Visualizzare la titolazione mediante colorazione con violetto di cristallo.
- Garantire l'accuratezza dei metodi di quantificazione virale.
Metodi Utilizzati
- Seeding di una linea cellulare preferita in una piastra a 96 pozzetti.
- Esecuzione di diluizioni decrescenti del ceppo virale.
- Vortex di ogni diluizione per un'adeguata miscelazione.
- Colorazione con violetto di cristallo dopo un periodo di incubazione di sette giorni.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle titolazioni virali mediante violetto di cristallo.
- Il confronto con altri metodi di colorazione ha mostrato coerenza.
- Quantificazione accurata delle scorte virali ottenuta.
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- La colorazione con violetto cristallino è un metodo efficace per visualizzare le titolazioni virali.
- Il protocollo migliora l'accuratezza della quantificazione virale.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una titolazione virale accurata è fondamentale per lo screening antivirale e lo sviluppo di vaccini, in cui un rilevamento incoerente del CPE può compromettere l'identificazione dei candidati promettenti e le decisioni di proseguimento o interruzione. La colorazione con violetto di cristallo offre un'alternativa economica e riproducibile rispetto alla colorazione immunocitochimica, migliorando la standardizzazione del saggio e riducendo la variabilità nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva delle valutazioni dell'efficacia antivirale e consente screening scalabili ad alto rendimento basati sul TCID50 per virus che inducono il CPE.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente una quantificazione oggettiva dell'infettività virale, riducendo la dipendenza dalla microscopia soggettiva e supportando la riduzione dei rischi meccanicistici dei bersagli antivirali.
- Valore operativo: Fornisce un metodo di colorazione rapido ed economico che aumenta la produttività e la riproducibilità del saggio nella validazione dei composti antivirali attivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera endpoint chiari e quantificabili per i saggi TCID50, migliorando il rapporto segnale-rumore nelle campagne di screening di composti.
- Valore operativo: Elimina la necessità di reagenti ICC costosi, riducendo il costo per saggio e consentendo un'applicazione più ampia su diverse piattaforme di scoperta di antivirali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni del titolo virale costanti tra diversi studi, sostenendo modelli dose-risposta affidabili negli studi preclinici di efficacia.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione tra laboratori nella preparazione delle scorte virali, riducendo la variabilità tra esperimenti negli studi finalizzati al deposito dell'IND.
Pipeline e integrazione del flusso di lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta di agenti antivirali, dalla conferma iniziale dell'attività all'ottimizzazione del composto leader, in cui la titolazione accurata del virus fornisce informazioni per le relazioni struttura-attività e il profilo di resistenza.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo modelli riproducibili di infezione virale per studi sui meccanismi d'azione.
- Screening: Fornisce risultati standardizzati e quantificabili essenziali per la progressione da hit a lead nei processi di screening antivirale.
- Analisi: Permette il calcolo preciso dei valori di TCID50, consentendo un confronto accurato della potenza dei composti in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Garantisce continuità dallo screening antivirale in vitro ai modelli di infezione in vivo attraverso una quantificazione costante delle scorte virali.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità scalabile e a basso costo applicabile a diversi bersagli virali e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva dell'efficacia antivirale riducendo i falsi negativi derivanti dalla valutazione visiva del CPE.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità dei saggi TCID50 grazie a una colorazione semplificata e standardizzata.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale nei programmi antivirali riducendo i costi dei saggi senza compromettere la qualità dei dati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette in base al rischio fornendo dati affidabili sulla titolazione virale per criteri di prosegui/non prosegui.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede una formazione di base in virologia e tecniche asettiche per la manipolazione sicura dei virus in ambienti BSL-2.
- Si basa su attrezzature di laboratorio standard, inclusi incubatori, centrifughe e lettori di piastre per la quantificazione opzionale.
- Necessita di un accordo condiviso tra i gruppi di lavoro sulla durata della colorazione e sui protocolli di lavaggio per garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Applicabile a linee cellulari aderenti che supportano la formazione di effetti citopatici; potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per virus non aderenti o che non inducono effetti citopatici.
- Limitato ai virus che inducono un effetto citopatico rilevabile; non adatto a modelli di infezione non citopatici o persistenti senza modifiche.
