Amplificazione di Escherichia coli in un chip microfluidico PCR a flusso continuo e sua rilevazione con un sistema di elettroforesi capillare

Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato sul chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un modo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio. La reazione a catena della polimerasi è un metodo tradizionale impiegato per l'amplificazione del gene bersaglio.

Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell'efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo basato sul chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse.

Poiché il CE presenta molti vantaggi, come l'alta risoluzione, l'alta velocità e l'eccellente riproducibilità, è diventato uno strumento popolare in laboratorio per l'analisi di acidi nucleici e proteine. Tuttavia, la maggior parte dei laboratori, in particolare i laboratori nei paesi in via di sviluppo, non possono permettersi questa tecnologia a causa del prezzo elevato dello strumento CE. In questo articolo, abbiamo delineato i protocolli su come fabbricare il chip microfluidico CF-PCR e su come costruire un sistema CE versatile in laboratorio.

Dimostriamo inoltre il processo di amplificazione di Escherichia coli da parte del sistema CF-PCR e la rilevazione dei prodotti PCR da parte del sistema CE. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli utenti dovrebbero essere in grado di fabbricare chip microfluidici, preparare la soluzione PCR, costruire un sistema CF-PCR per l'amplificazione degli acidi nucleici e impostare un semplice sistema CE, anche con risorse limitate, per separare i frammenti di DNA. Riscaldare il wafer di silicio a 200 gradi centigradi per 25 minuti per rimuovere l'umidità.

Erogare un millilitro di fotoresist SU-8 2075 per pollice del wafer. Centrifugarlo sul wafer di silicio utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 5-10 secondi con un'accelerazione di 100 giri/min al secondo, quindi a 2.000 giri/min per 30 secondi con un'accelerazione di 500 giri/min al secondo. Cuocetelo a 65 gradi centigradi per tre minuti e a 95 gradi centigradi per 15 minuti.

Impostare da 150 a 215 millijoule per centimetro quadrato come energia di esposizione per la macchina per fotolitografia e incidere il modello progettato sul fotoresist con una maschera per fotolitografia. Posizionare il wafer di silicio e la maschera pronti per l'esposizione. Dopo l'esposizione, cuocere il wafer a 65 gradi centigradi per due minuti e a 95 gradi centigradi per sette minuti.

Immergere il wafer di silicio nella soluzione di sviluppo per rimuovere il fotoresist in eccesso ed estrarlo quando i microcanali sono visibili. Quindi utilizzare l'isopropanolo per risciacquare la soluzione di rivelatore residua. Miscelare il prepolimero di polidimetilsilossano e l'agente indurente in un rapporto di 10 a 1.

Versare la soluzione PDMS miscelata nello stampo replica e solidificarla a 80 gradi centigradi per 60 minuti. Incollare il chip microfluidico PDMS su un vetrino dopo l'attivazione utilizzando un pulitore al plasma e solidificarlo a 80 gradi centigradi per 30 minuti il prima possibile. Utilizzare un miscelatore a vortice e una centrifuga per assicurarsi che i reagenti siano ben miscelati.

Preparare una provetta da centrifuga. Per prima cosa aggiungere acqua alla provetta da centrifuga. Quindi aggiungere il modello di DNA, il primer, il tampone, la miscela di dNTP, Tween 20, PVP e infine aggiungere la DNA polimerasi.

Infine, miscelare la soluzione mediante vortice. Preparare due riscaldatori ceramici PTC, due relè a stato solido, due regolatori di temperatura, due sensori di temperatura e un cavo di alimentazione. Collegare il riscaldatore al relè a stato solido.

Collegare il relè a stato solido al regolatore di temperatura PID. Quindi collegare la sonda del sensore di temperatura alla parte inferiore dei due riscaldatori e collegare il terminale al regolatore di temperatura PID. Infine, collegare due relè a stato solido in serie e collegare il cavo di alimentazione.

Stampa in 3D una fessura per i due riscaldatori e mantieni i riscaldatori sullo stesso piano. Posizionare il chip microfluidico sui due riscaldatori. Preparare una pompa a siringa e una siringa, quindi fissare la siringa sulla pompa a siringa.

Collegare un tubo di silicone con una siringa e collegare un ago d'acciaio alla parte superiore del tubo di silicone. Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico. Posizionare un puntale di pipetta all'uscita del chip per raccogliere i prodotti PCR.

Utilizzare un alimentatore ad alta tensione per generare un campo elettrico pulsato. Guarda, questo è un alimentatore ad alta tensione. Si tratta di elettrodi positivi e negativi.

Utilizzare una lampada al mercurio come fonte di luce e filtrare la lunghezza d'onda di eccitazione dalla lampada al mercurio attraverso un filtro. Posizionare il capillare sul tavolino del microscopio. Raccogliere l'emissione di fluorescenza con l'obiettivo, quindi rilevarla da un tubo fotomoltiplicatore.

Questo è il nostro microscopio e questo è il nostro capillare. Ora accendiamo la luce in condizioni di stanza buia. La luce di eccitazione viene raccolta dall'obiettivo.

Utilizza il software LABVIEW sviluppato internamente per controllare l'alimentazione e completare l'acquisizione dei dati. Preimpostare la temperatura dei riscaldatori del sistema CF-PCR a 65 gradi centigradi e 95 gradi centigradi. Posizionare il chip microfluidico sui due blocchi riscaldanti.

Inserire la punta della provetta in silicone in una provetta da centrifuga contenente 50 microlitri di soluzione PCR. Tirare lo stantuffo della siringa per prelevare lentamente la soluzione. Fissare la siringa su una pompa a siringa.

Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico. Impostare la portata della pompa a 10 microlitri al minuto e premere il pulsante di avvio per spingere la soluzione nel microcanale all'ingresso del microchip. Raccogliere i prodotti PCR all'uscita del chip microfluidico.

Preparare un capillare con 8 centimetri di lunghezza totale e 6 centimetri di lunghezza effettiva. Preparare il tampone di separazione mescolando 100 microlitri di 1%HEC, due microlitri di 100x SYBR Green e 98 microlitri di acqua ultrapura per ottenere lo 0,5%HEC contenente 1x SYBR Green. Riempire il capillare con il tampone di separazione preparato utilizzando una pompa a vuoto.

Inserire la tensione di iniezione e il tempo di iniezione sull'interfaccia software, fare clic sul pulsante di avvio e attendere che i prodotti PCR vengano introdotti elettrodinamicamente nel capillare. Immettere la tensione CC sull'interfaccia del software, fare clic sul pulsante di avvio ed eseguire l'elettroforesi a 100 volt per centimetro di intensità del campo elettrico. Fare clic sul pulsante di arresto dopo che tutti i frammenti di DNA sono stati separati nel capillare.

Sciacquare il capillare con acqua sterilizzata per un minuto dopo ogni corsa. Questa immagine rappresenta l'elettroferogramma dei prodotti PCR e dei marcatori del DNA. Per prima cosa abbiamo amplificato il gene bersaglio di Escherichia coli nel sistema CF-PCR e la soluzione PCR ha impiegato circa 10 minuti e 30 secondi dall'ingresso all'uscita del chip.

La dimensione dell'amplicone bersaglio di Escherichia coli era di 544 bp. Successivamente, abbiamo analizzato i prodotti di PCR amplificati nel sistema di elettroforesi capillare. Inoltre, abbiamo anche eseguito l'elettroforesi capillare della scala del DNA a 100 bp nelle stesse condizioni sperimentali.

La dimensione del prodotto PCR può essere valutata in base all'elettroferogramma della scala del DNA. Ogni esperimento è stato eseguito tre volte per verificarne la riproducibilità. I dati in questa immagine mostrano che il picco corrispondente ai prodotti PCR di Escherichia coli è stato osservato dopo la separazione e il tempo di migrazione dei prodotti PCR nel chip microfluidico era coerente con quello in un termociclatore.

Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell'analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l'amplificazione di Escherichia coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di Escherichia coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti e i frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro otto minuti.

Inoltre, il sistema CF-PCR basato sul chip microfluidico e il sistema CE introdotto in questo lavoro sono facili da fabbricare e possono offrire un modo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio. È in grado di amplificare e rilevare un solo campione alla volta, il che ne limita l'ampia applicazione. Pertanto, lo sviluppo di un array di chip microfluidici integrati CF-PCR e CE per il rilevamento ad alto rendimento di agenti patogeni è ancora in corso.