Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Ciao, mi chiamo Matt Lui. Sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio di Leslie Sal presso la Rockefeller University. Oggi vorrei raccontarvi degli esperimenti che abbiamo condotto per studiare la chemotassi larvale.

Il problema che ci interessa è piuttosto semplice. È effettivamente rappresentato qui in questa configurazione. Ho appena trasferito un gruppo di larve di Joseph su questa superficie di agros.

Questo ambiente è piuttosto ostile e gli animali sono prossimi alla fame. In qualche modo, questi animali dovranno trovare la strada verso la fonte di cibo più vicina e qui ci sono delle banane che emettono un odore in grado di attirare le larve. Questo ambiente non è ideale per studiare il comportamento di chemotassi, quindi il primo miglioramento consisterà nel sostituire la banana con una sostanza chimica.

Questo composto chimico è l'acetato di isopropile ed è uno dei sapori predominanti nella banana. Si tratta quindi di un aroma artificiale che ci consente un controllo molto migliore dello stimolo olfattivo. Il passo successivo consiste nell'utilizzare un ambiente chiuso e nel tentare di prevenire in tal modo le fluttuazioni nella distribuzione dell'odore.

Quindi ecco il saggio che stiamo utilizzando in laboratorio da molto tempo. Si tratta di una piastra di Petri con una superficie di agarro sul fondo. L'agarro è ideale per i test chemiotattici su larve perché mantiene l'idratazione.

Sui due lati della piastra, troverete un altro coperchio fatto di Teflon e quello che faremo ora è introdurre acetato di isopentile da un lato e nessun ordine dall'altro lato. Una volta fatto ciò, l'idea è chiudere la capsula di Petri, attendere un breve periodo affinché l'odore si diffonda, quindi aprire la capsula. Introdurre qui un animale e lasciamo che l'animale si muova per un certo periodo di tempo.

Questo saggio si basa sull'assunzione che introducendo l'odorante su un lato della piastra, si stabilisca rapidamente un gradiente che rimarrà stabile per tutta la durata del test. Ora il problema principale è che nessuno ha mai dimostrato che il gradiente esista effettivamente nella piastra. Potrebbe benissimo accadere che, molto rapidamente dopo l'aggiunta dell'odorante, si abbia una distribuzione omogenea dell'odorante nella piastra, in modo tale che il gradiente risulti molto debole, oppure potrebbe essere necessario diversi minuti perché il gradiente si stabilisca.

Ciò dipenderà ovviamente principalmente dalla pressione di vapore del teodor utilizzato. Il secondo aspetto riguarda ciò che viene quantificato durante l'esperimento. Immaginiamo che un animale parta da qui, la X, e dopo tre minuti si trovi su questa piastra terminale, la X rossa. Ora esistono due approcci possibili.

Una cosa che si può fare è registrare soltanto la posizione finale dell'animale dopo un determinato periodo di tempo, tre o cinque minuti. In questo modo, l'unica informazione che si otterrebbe sarebbe la posizione iniziale e quella finale, e riteniamo sia importante disporre di una buona risoluzione riguardo al comportamento dell'animale nel tempo. Ad esempio, un animale potrebbe essersi spostato di poco dalla posizione iniziale a quella finale, come in questo caso, oppure potrebbe aver visitato molto bene la regione circostante theodor per una porzione significativa del tempo, per poi tornarvi prima della fine della prova.

La conclusione che trarremmo da queste due situazioni è molto diversa. In un caso, l'animale potrebbe non aver risposto allo stimolo, mentre nell'altro caso l'ha certamente fatto. I due miglioramenti che cerchiamo di ottenere sono, in primo luogo, controllare la forma e la stabilità dell'altro gradiente nell'arena.

In secondo luogo, monitorare il comportamento dell'animale in tempo reale e conservare tutte queste informazioni. Nella sequenza successiva, Sylvia vi mostrerà come prepariamo il diluente d'ordine. Il mio nome è S ti.

Sono un assistente di ricerca nel laboratorio del dottor VAs e lavoro per il materiale lui. Oggi vi mostrerò come preparare i materiali per il sistema di camere che utilizziamo per tracciare gli animali. Il problema principale del nostro sistema di camere è che stiamo utilizzando un odore disperso nell'aria.

Ciò significa che, ad esempio, se le piastre di agar che utilizziamo non sono perfettamente piane, potreste riscontrare fluttuazioni e variazioni di concentrazione tra esperimenti diversi, il che introdurrebbe rumore nel sistema. Vi mostrerò quindi alcune piccole indicazioni per cercare di ridurre tale rumore. I materiali necessari per preparare il vostro diluizione dell'odore sono un barattolo di vetro, preferibilmente in vetro scuro nel caso stiate utilizzando odori sensibili alla luce, e un'aliquote dell'odore di interesse.

Pipette di vetro per preparare questa aliquota e un idoneo ausilio meccanico per pipetta. Quindi punte per pipetta con olio di paraffina, il vostro pipettatore standard e provette piccole per la diluizione. Ancora una volta, questi devono essere in vetro e preferibilmente scuri, e poi una bilancia per effettuare misurazioni accurate e ridurre il rumore tra esperimenti.

Poiché gli odori sono altamente volatili e alcuni di essi sono tossici, le operazioni vengono eseguite all'interno di una cappa. Il primo passaggio per preparare un'opportuna diluizione di un odore consiste nel prelevare un'aliquote dell'odore che si intende diluire. Per preparare diluizioni accurate e ridurre al minimo le variazioni tra esperimenti, è necessario pesare tutti i componenti.

Quindi iniziare etichettando, si preparerà una concentrazione di un molare di butirrato di etile. Per prima cosa, preparare l'olio di paraffina. L'olio di paraffina è molto viscoso, quindi è importante cercare di immergere la punta della pipetta il meno possibile nell'olio di paraffina, giusto abbastanza da poter aspirare l'olio senza generare bolle d'aria.

Quindi è consigliabile rimuovere l'eccesso di olio di paraffina sul lato della bottiglia. Ancora una volta, poiché l'olio di paraffina è viscoso, è molto importante versarlo lentamente nel flacone. Una volta pipettato l'olio di paraffina nel flacone, non gettate immediatamente via il puntale, perché altro liquido si accumulerà nella parte inferiore del puntale.

È consigliabile preparare un foglio di calcolo prima di iniziare il processo di diluizione, in cui si riportano già il volume di olio di paraffina che si intende aggiungere e il relativo peso, e fare altrettanto per l'odore, indicandone anche il peso. In questo modo è possibile verificare sulla bilancia di avere tutto l'olio di paraffina necessario e tutto l'odore richiesto. Se necessario, aggiungere altro olio di paraffina e ripetere la pesata fino a raggiungere il peso corretto.

Una volta ottenuto il peso corretto dell'olio di paren, tutto ciò che occorre fare è aggiungere l'odorante seguendo gli stessi principi. Bene. Qui mostrerò come preparare le larve per il tracciamento.

Di solito utilizziamo larve di sei giorni di età. Lo facciamo perché sono abbastanza grandi da essere individuate facilmente dal nostro software e sono ancora molto attive. Per verificare se le larve sono troppo vecchie per essere utilizzate nel tracciamento, è sufficiente controllare se alcune stanno risalendo lungo le pareti. Se ci sono larve che risalgono lungo la parete, sono troppo vecchie e non saranno particolarmente attive.

Il primo passo nella preparazione delle larve consiste nell'immergerle in una soluzione di saccarosio al 15%. Utilizziamo saccarosio al 15% perché le larve galleggeranno in questa soluzione, mentre il cibo si scioglierà parzialmente oppure precipiterà sul fondo. Versare una quantità sufficiente di saccarosio in modo che raggiunga circa, ma leggermente meno di, un pollice dal bordo superiore della bottiglia o del vial.

Quindi prendete una spatola. Potete già vedere le larve che galleggiano in superficie; delicatamente scavate nel mezzo di coltura per staccare gli animali che vi si sono insinuati, agitate leggermente per separarli dal mezzo e poi lasciate riposare per alcuni minuti. Una volta che il mezzo di coltura e le larve si sono separati adeguatamente, prendete una piastra di Petri pre-etichettata e versatele nella parte del beeper.

Mantieni il coperchio della piastra di Petri poiché lo riempirai d'acqua e lo userai come contenitore per le larve monitorate, in modo da poter distinguere quelle già analizzate da quelle ancora da analizzare. Ora che hai versato le larve nella piastra di Petri, devi aspettare 30 minuti affinché si adattino al saccarosio e raggiungano uno stato di privazione alimentare. Ciò significa che si comporteranno in modo più ottimale durante la fase di monitoraggio, mentre le larve si adattano per 30 minuti.

Il saccarosio è un buon momento per preparare le piastre per il tracciamento. Queste sono le parti superiori di piastre a 96 pozzetti. È possibile acquistarle separatamente e questa è una soluzione di agarosio al 3% che è già stata riscaldata.

Utilizziamo l'agarosio al 3% perché impedisce alle larve di scavare, ma è sufficientemente denso da permettere loro di camminarci sopra e di mantenere l'umidità su ciascun coperchio della piastra. È necessario pipettare 25 mil di agarosio. È importante cercare di evitare la formazione di bolle grandi nel gel.

È inoltre importante posizionare le piastre su una superficie piana, altrimenti si potrebbero ottenere gel inclinati che potrebbero influenzare il comportamento delle larve. Dopo che il gel si è solidificato, impiliamo i coperchi e li avvolgiamo con pellicola trasparente per evitarne l'essiccazione. Questo permette di mantenerli in buone condizioni per l'analisi comportamentale per diversi giorni.

In questa sequenza, vi presenterò il nostro saggio comportamentale, che differisce leggermente dal saggio con la piastra di Petri di cui vi ho parlato in precedenza. Ciò di cui avrete bisogno sono piastre a 96 pozzetti, sia quelle vuote sia quelle contenenti lo strato di agar. Il saggio è composto da tre coperchi, disposti uno sopra l'altro.

Il primo strato è vuoto e viene utilizzato esclusivamente per isolare il sistema dalla superficie su cui poggia. Il secondo strato contiene la superficie in agar Diego. Qui gli animali verranno posizionati sulla superficie e, come mostrerò ora, introduciamo theodor nella piastra.

È importante utilizzare un coperchio fresco e nuovo ogni volta che si carica il theodor. Questo serve a prevenire qualsiasi contaminazione da un esperimento all'altro. Sarà inoltre necessaria un'altra diluizione.

Normalmente non utilizziamo un colorante per caricare theodor, ma qui lo userò a scopo illustrativo. Questa è una concentrazione elevata di theodor. Mentre questa è molto diluita, il mio obiettivo sarà creare un gradiente lungo una linea.

Dica questa frase e vogliamo ottenere una concentrazione crescente da sinistra a destra. Per ottenere questo risultato, utilizzerò diverse gocce disposte in ordine sul ring di condensazione con concentrazioni crescenti. Partirò dalla concentrazione più alta, che verrà posizionata all'estremità.

È importante disperderlo nell'anello. Ora passo alla concentrazione successiva, che è diluita due volte rispetto alla prima, e la pongo in questo anello. Quindi, no, ho sei gocce.

Il primo contiene una concentrazione, ad esempio, di uno. Il secondo ha una concentrazione di 0,5, la metà rispetto al primo. Il terzo ha una concentrazione di 0,25 e così via.

Abbiamo quindi una serie geometrica lungo la linea. Il passo successivo consiste nell'invertire questo coperchio sulla superficie dell'AAL e, grazie alla tensione superficiale, tutte le goccioline rimangono sospese sulla parte superiore del coperchio. Abbiamo ideato una tecnica basata sulla spettroscopia infrarossa per misurare la concentrazione totale nella piastra.

Applicando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che, se si ha una serie geometrica lungo la linea del deodorante qui mostrata, si ottiene una concentrazione di teodor lungo la lunghezza che aumenta esponenzialmente come illustrato qui e lungo la larghezza della piastra. Abbiamo un profilo che raggiunge il massimo proprio al di sotto della linea dell'odorante. Ecco come appare effettivamente la geometria del gradiente.

Se si considera la concentrazione di teodor nell'aria, il punto positivo è che siamo riusciti a dimostrare che il gradiente e la sua geometria rimangono stabili per almeno 15 minuti. Dopo aver inserito il coperchio superiore, attendiamo 30 secondi per permettere al gradiente di stabilizzarsi. Successivamente introduciamo l'animale nell'arena.

L'animale viene introdotto sotto l'estremità opposta tra la posizione tre e quattro; utilizziamo un piccolo perno per trasferire le larve dalla soluzione di saccarosio alla superficie dell'agar. Il trasferimento avviene catturando una larva intorno alla testa del perno. Apriamo rapidamente il coperchio e la larva viene depositata sulla superficie dell'agar.

Quindi chiudiamo il coperchio. È importante ridurre al minimo il tempo durante il quale il coperchio rimane aperto. Successivamente, si registra il movimento dell'animale per tre o cinque minuti.

Viene effettuata la registrazione effettiva. Con questa configurazione di tracciamento, disponiamo di una telecamera collegata a un computer. Il software di tracciamento delle immagini che utilizziamo è Aton vision di Nordis, che raccoglie le informazioni sul movimento dell'animale e le memorizza come file digitale.

Ora siamo pronti per iniziare l'esperimento comportamentale. Abbiamo il coperchio con lo strato di aro. Abbiamo le diluizioni.

Diego è bloccato sul primo tappo. Prima di caricare theodor, è importante vortexare ogni provetta. Utilizziamo la nostra diluizione con la più piccola a sinistra e la più alta a destra.

Tutte e sei le gocce verranno depositate sulla piastra contemporaneamente. Per evitare la perdita di odore, utilizziamo qui una pipetta multicanale a sei canali; vengono prelevati 10 microlitri di odore da ciascun campione di diluizione e l'odore viene depositato simultaneamente. Dopo il caricamento, il coperchio viene capovolto sulla superficie dell'agar.

Il gradiente è stato creato nella piastra negli ultimi 30 secondi, come vi ho mostrato in precedenza. Ora introdurrò un animale sulla superficie di Diego. Non appena l'animale sarà stato introdotto, inizierò la registrazione.

L'animale è qui e il suo movimento viene attualmente tracciato. Come si può vedere, l'animale sta seguendo la traccia dell'odorante e si sta dirigendo verso il punto di massima concentrazione del gradiente. Ricordare che la concentrazione aumenta da sinistra a destra con un andamento esponenziale.

Come si può notare, la direzione del movimento viene corretta costantemente. Rispetto allo stimolo, l'animale ha ora raggiunto il punto di concentrazione massima del gradiente, e lo rimuoviamo dalla piastra. L'animale viene scartato su un'altra piastra per assicurarci di non tracciare lo stesso individuo due volte consecutivamente.

Dopo aver introdotto una nuova larva e avviato una nuova registrazione, seguiamo queste regole per il tracciamento. Interrompiamo il tracciamento non appena l'animale ha raggiunto la fila con la concentrazione più alta della piastra, che corrisponde a questa, proprio qui. Inoltre, se un animale urta contro la parete, il tracciamento viene interrotto perché vogliamo evitare qualsiasi interferenza.

La prima domanda che abbiamo affrontato era abbastanza semplice. Volevamo sapere se un animale fosse in grado o meno di percepire l'odore del teodor a una certa concentrazione. Per effettuare un simile test, ciò che di solito facciamo è utilizzare una singola fonte di odore anziché diverse.

Questo consente di avere un grado di libertà nella modifica della concentrazione nella goccia terminale. Ad esempio, qui si ha una goccia ad alta concentrazione e qui una goccia a bassa concentrazione. Quello che di solito facciamo è posizionare l'animale sulla superficie di Diego proprio al di sotto della goccia di Theodor e osservare se l'animale è in grado di rilevarne la presenza e rimanere nelle sue vicinanze.

Ora vorrei fare un uso più avanzato del nostro saggio. Immagini di avere una goccia di ordine e di registrare diverse traiettorie che sono sovrapposte qui, e di averne tre. Ha un singolo individuo che genera questa traccia verde.

Hai questa traccia arancione che è meno centrale, e poi hai questa traiettoria rosa che rappresenta un animale che apparentemente gira intorno alla sorgente. Crediamo che ci siano molte informazioni da analizzare riguardo ai dettagli delle traiettorie. Per questo motivo, importiamo la traiettoria come una serie di posizioni in matlab, e svolgiamo l'analisi successivamente mediante matlab.

Ecco la distanza dalla sorgente probabilmente in funzione del tempo. Per le tre traiettorie mostrate in precedenza, si ha la traiettoria verde, che rimane molto vicina alla sorgente. Si ha poi la traiettoria arancione, che presenta un rumore significativamente maggiore.

E poi si ha questa traiettoria viola, che in modo interessante ha mostrato come l'animale abbia lasciato la sorgente per mantenere una certa distanza, la quale probabilmente corrispondeva a una concentrazione ottimale. Qui si vede l'illustrazione di 10 traiettorie, di animali incapaci di odorare. Si tratta di mutanti o di mutanti three B, che sono non ellers.

E come puoi vedere, tutte queste traiettorie illustrano che gli animali non sono riusciti a rilevare la fonte dell'odore e l'hanno semplicemente abbandonata. Ora, in netto contrasto, abbiamo registrato qui 10 traiettorie consecutive per animali con tappo bianco. Questi animali sono ovviamente in grado di odorare, e come puoi vedere, tutti si accumulano proprio sotto la fonte del deodorante.

Le 20 traiettorie, che sono state appena presentate, sono state in realtà acquisite senza conoscere l'identità degli animali. Questo dimostra l'efficienza e l'affidabilità del nostro saggio. Per determinare se alcuni Mutanti sono in grado di percepire l'odore in un gradiente esponenziale, generiamo diverse tracce e desideriamo valutare quanto bene gli animali siano in grado di seguire lo stimolo all'altra estremità.

Quindi ora vi mostrerò 15 traiettorie registrate separatamente e, come potete vedere, gli animali svolgono un lavoro eccellente nel seguire lo stimolo lungo la linea terminale. Ora vorremmo procedere con un semplice controllo. È possibile che gli animali nel gradiente esponenziale abbiano seguito la linea a causa della presenza di uno stimolo indipendentemente dalla sua concentrazione, ovvero che gli animali abbiano semplicemente proseguito in linea retta.

Quindi, per dimostrare che effettivamente stanno calcolando la concentrazione o qualcosa ad essa correlato, e che utilizzano questa informazione per guidare il loro movimento, abbiamo ora questa geometria, simile a un tetto spiovente. La larva viene introdotta qui come di consueto, e ciò che ci aspettiamo è che si muova lungo la linea, rilevi che la concentrazione diminuisce dopo questo punto e quindi vi ritorni. Abbiamo quindi eseguito il test con cinque animali.

Abbiamo raccolto le traiettorie e ora le stiamo rappresentando sovrapposte a questa diapositiva. Come si può vedere, gli animali sono partiti da qui, si sono mossi lungo la linea, quindi hanno esplorato la regione corrispondente alla concentrazione più elevata e vi sono rimasti prevalentemente. Ciò suggerisce fortemente che siano in grado di calcolare altre concentrazioni in tempo reale utilizzando il saggio con singola sorgente.

Siamo stati in grado di porre principalmente una grande domanda. Un animale può rilevare un odore a una certa concentrazione utilizzando un dispositivo a sorgente multipla? Abbiamo, disponiamo di maggiore flessibilità nel modificare la forma del gradiente e nel determinare se un animale è in grado o meno di utilizzare queste informazioni.

Vorrei illustrare questo concetto eseguendo un semplice esperimento. Nei gradienti finora impostati, avevamo una forma esponenziale lungo la lente. Ora ci si chiede: se sottoponiamo gli al a una sfida maggiore, facendo aumentare la concentrazione linearmente lungo la lente, saranno comunque in grado di raggiungere l'estremità opposta?

Questo grafico rappresenta i due tipi di gradiente. Abbiamo testato quello esponenziale in viola e il gradiente lineare in verde. Questo è il gradiente lineare, e procederò a scrivere le diverse concentrazioni di acetato di isam diluendo l'olio tra parentesi.

Questa è una serie aritmetica. Abbiamo un gradiente lineare che si stabilirà e, come si può vedere, la pendenza è piuttosto bassa rispetto al gradiente esponenziale qui, dove la concentrazione alle estremità è anch'essa 0,5, ma aumenta fino a 0,03. La domanda è: i batteri sono in grado di rispondere chimiotatticamente quando si trovano di fronte a un gradiente così lieve?

Qui, la concentrazione effettiva di acetato utilizzata nelle sei gocce per il gradiente esponenziale e per il gradiente lineare. Come si può vedere, anche se la concentrazione più alta è la stessa in entrambi i casi per il gradiente lineare, la concentrazione più bassa in questo caso è piuttosto elevata. Abbiamo eseguito l'esperimento con il gradiente lineare, e qui sono rappresentate 15 traiettorie di un animale di tipo selvatico, e riteniamo evidente che questi animali siano stati in grado di rilevare il gradiente lineare e seguire questo segnale lungo la linea del deodorante.

Quindi penso che il nostro punto sia chiaro. Prima di concludere, vorrei parlare brevemente delle possibili direzioni future per questa configurazione di tracciamento. Sebbene questa configurazione permetta di fare molte cose interessanti, ad esempio osservare comportamenti complessi nei larve per un periodo più lungo e su una superficie più ampia, presenta alcune limitazioni.

Ad esempio, si è limitati dalle dimensioni della piastra, il che limita la durata dell'osservazione e i comportamenti complessi che è possibile analizzare. Sarebbe quindi utile sviluppare un sistema in cui la piastra sia più grande oppure in cui non si sia affatto vincolati dai bordi della piastra. Un altro problema è che con il software attualmente disponibile risulta difficile tracciare più di un animale contemporaneamente, rendendo impossibile osservare i comportamenti di popolazione in tempo reale.

Un altro aspetto interessante del comportamento che non possiamo verificare con questa configurazione è il movimento tridimensionale effettivo delle larve nello spazio. Mentre si tracciano gli animali, si osserva che, ad esempio, quando raggiungono una goccia di odore, potrebbero sollevare la testa o muoverla lateralmente cercando di rilevare variazioni nella concentrazione. Probabilmente ciò non è possibile con la nostra configurazione attuale, quindi sarebbe utile sviluppare un sistema che ci permetta di effettuare tali osservazioni.