Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca²⁺ nei miociti dei roditori

Questo approccio rileva i cambiamenti nella funzione contrattile durante lo sviluppo dell'insufficienza cardiaca. Anche la risposta funzionale nei miociti ai neuroormoni e ai potenziali agenti terapeutici può essere sottoposta a screening. Il posizionamento del miocita può richiedere pratica, ma è essenziale per ottenere una imaging coerente della lunghezza del sarcomero.

A dimostrare la procedura è Margaret Westfall, professore associato e ricercatore principale del laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare un impacco di gel e un supporto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Accendere i componenti della piattaforma della funzione contrattile come menzionato nel manoscritto e assemblare i tubi nella pompa peristaltica.

Quindi, trasferire il pacco di gel preriscaldato nel supporto del tubo e accendere il vuoto nell'alimentazione dello stimolatore cellulare. Posizionare un tubo da 50 millilitri con il fluido nel supporto del tubo isolato per iniziare la perfusione a 0,5 millilitri al minuto attraverso il tubo della pompa peristaltica. Quindi, aggiungere due millilitri di fluido preriscaldato a una piccola barca di pesatura e trasferire un vetrino di copertura contenente miociti dalla camera di stimolazione al battello di pesatura.

Riportare la camera di stimolazione nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Rimuovere il vetrino di copertura dal contenitore di pesatura e pulire delicatamente la parte inferiore prima di trasferirlo in una camera di copertura appena unta e aggiungere una goccia di supporto sul vetrino di copertura. Posizionare un supporto per elettrodo di platino sopra la linguetta del coperchio, quindi posizionare una nuova sottoveste di copertura sopra la parte superiore con una pinza e posizionare un supporto superiore sopra il sandwich della sottoveste di copertura.

Installare due o quattro viti a testa di panhead numero zero per completare l'assemblaggio della camera. Nella pompa peristaltica, quando il fluido è presente in tutto il tubo, collegare il tubo al preriscaldatore e il preriscaldatore alla camera di scorrimento del coperchio. Quindi, iniziare la perfusione a 0,5 millilitri al minuto e posizionare una salvietta di tessuto sotto la camera per garantire che non ci siano perdite.

Dopo aver posizionato la camera di scorrimento del coperchio nell'adattatore di palcoscenico del microscopio, accendere l'impianto di riscaldamento ed equilibriare il gruppo per cinque-10 minuti per ottenere una temperatura costante del fluido di 37 gradi Celsius al centro della camera. Osservare il mezzo perfuso che viene raccolto all'estremità opposta della camera con tubi collegati a un sistema di vuoto. Durante il tempo di equilibrio, visualizzare i miociti con l'obiettivo di immersione in acqua 40x sul microscopio.

Per attivare lo stimolatore di stimolazione, impostare la tensione da 35 a 40 volt e regolare la frequenza di stimolazione a 0,2 hertz per ottimizzare la funzione contrattile e la sopravvivenza dei miociti. Per raccogliere le tracce di accorciamento del sarcomero, aprire il software sul computer e selezionare OK, file e nuove schede. Preparare un modello di schermo selezionando le tracce, modificare i limiti utente e la lunghezza del sarcomero.

Registrare le tracce di lunghezza del sarcomero con il file e le nuove linguette, identificare un miocita in contrazione e posizionare il miocita lungo l'asse longitudinale della telecamera in modo che il modello di striatura sia verticale. Utilizzare il mouse del computer per posizionare la regione di interesse o la casella ROI sul miocita. Selezionare raccogliere e iniziare a registrare la funzione contrattile.

Registrare l'accorciamento per 60 secondi da ciascun miocita a basse frequenze di stimolazione di 0,5 hertz. Registra l'accorciamento del sarcomero da cinque a 10 celle per vetrina. Per misurare l'accorciamento su un intervallo di frequenze, posizionare i miociti su ciascuna frequenza per ottenere un accorciamento dello stato stazionario prima della registrazione.

Raddoppia la velocità di perfusione e inizia a registrare da 15 a 20 secondi dopo la stimolazione a una nuova frequenza nell'intervallo da 0,2 a due hertz e registra non più di due miociti per vetrino di copertura per accorciare la gamma data di frequenze di stimolazione. Registrare almeno sette contrazioni per cellula per ottenere dati mediati del segnale affidabili. Selezionare il file, scegliere una traccia registrata e quindi selezionare Apri.

Selezionare la scheda uno della traccia di base e quindi impostare il pannello giallo nella parte superiore della traccia per ottenere la lunghezza sarc. Preparare un modello di analisi con le opzioni di analisi temporanea monotona delle operazioni e il segno di evento TTL nella casella definizione di T Zero nelle opzioni necessarie dal menu. Salvare queste opzioni di analisi selezionando i modelli e salvare il modello di analisi con un identificatore.

Caricare il modello di analisi prima di analizzare ogni traccia. Per analizzare i dati, selezionare i segni, il gate, aggiungere i transienti, quindi convertire dal contrassegno di evento e dall'intervallo di analisi. Impostare l'intervallo di tempo da meno 0,01 a 1,20 secondi per i miociti a 0,2 hertz.

Selezionare un intervallo di tempo più breve per i miociti stimolati a frequenze più elevate. Selezionare le operazioni e gli eventi medi per produrre una registrazione media del segnale al di sotto della traccia di base originale. Quindi, selezionare la scheda uno della traccia media del segnale, quindi andare ai segni nel menu superiore seguita da aggiungi transitorio, scegliere operazioni e analisi transitoria monotona per visualizzare i valori medi del segnale per i parametri del sarcomero di base nel pannello di visualizzazione del segnale mediato.

Selezionare l'esportazione dell'analisi dei transitori monotoni e della corrente degli appunti e trasferire l'analisi del sarcomero transitorio in un foglio di calcolo per l'analisi composita di più miociti. Per copiare la traccia media del segnale, selezionare Esporta, Traccia corrente, quindi Appunti e schede delle opzioni in ordine e impostare le cifre decimali su cinque. Scegliere il delimitatore di schede e fare clic su OK.

Accelera la media delle tracce del segnale per ogni registrazione di miociti in un secondo foglio di calcolo. Lo studio ha dimostrato che il sovraccarico di pressione o PO, ha ridotto la funzione contrattile dei miociti rispetto al gruppo fittizio. Tuttavia, quattro giorni dopo il trasferimento genico della troponina cardiaca IT 144D o cTnIT144D, la capacità contrattile nei miociti PO è tornata verso livelli fittizi, indicando che la funzione dei miociti potrebbe essere ripristinata.

Negli studi iniziali, il trasferimento genico di cTnIT144D ha migliorato l'accorciamento del picco e livelli diastolici elevati di calcio rispetto a CTnI. Spesso sono necessari aggiustamenti fini nel posizionamento del miocita cardiaco per ottenere chiare tracce di accorciamento. Questo protocollo può anche essere eseguito su miociti cardiaci caricati con coloranti fluorescenti sensibili al calcio come Fura-2 AM per rilevare transitori di calcio oltre all'accorciamento.