Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Questo metodo descrive l'approvvigionamento chirurgico di tre lembi suini vascolarizzati e la loro successiva decellularizzazione della perfusione. Questo metodo può aiutare gli sforzi per rigenerare i lembi suini utilizzando un approccio di decellularizzazione e ricellularizzazione dei tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua versatilità per ottenere la decellularizzazione a profusione attraverso una varietà di lembi suini vascolarizzati in una configurazione di bioreattore semplice da assemblare.

La tecnica qui descritta può essere ampiamente applicata ad altri lembi vascolarizzati come potenziale soluzione di ingegneria tissutale utilizzando i lembi suini nella chirurgia ricostruttiva. Per iniziare, crea un tubo di afflusso e deflusso misurando circa 50 centimetri di tubi in silicone rivestiti di platino LS16. Collegare un'estremità a un tubo giallo della pompa a 3 stop e l'altra a una pipetta sierologica sterile da 2 millilitri per trasportare il perfusato dai serbatoi del detergente nella camera del bioreattore.

Autoclavare la camera e i tubi in imballaggi sterili confezionati singolarmente. Per l'approvvigionamento del lembo omentale, posizionare un maiale dello Yorkshire anestetizzato di 12 settimane in posizione supina, quindi preparare l'addome nel solito modo sterile. Eseguire una laparotomia xifo-ombelicale per entrare nell'addome e mobilizzare il cefalo dello stomaco e posizionare l'omento nel campo operatorio.

A partire dall'aspetto sinistro della curvatura maggiore, dove l'arteria gastroepiploica sinistra si unisce all'arteria splenica, scheletrizzare l'arteria gastroepiploica sinistra e la vena usando le forbici per tenotomia di Stevens dritte. Quindi legare e dividere entrambi separatamente usando fascette chirurgiche o clip. Procedere lungo la maggiore curvatura dello stomaco da sinistra a destra per legare e dividere i brevi rami vascolari derivanti dall'omento, fornendo la maggiore curvatura dello stomaco.

Continuare la mobilizzazione dell'omento maggiore fino a quando non si incontra la giunzione dei vasi gastroepiploici destro e dell'arteria gastroduodenale. Quindi legare e dividere l'arteria gastroepiploica destra e la vena per liberare il lembo omentale e consentire l'incannulamento del lembo in seguito. Per l'approvvigionamento del lembo tensoriale della fascia lata, posizionare il maiale nella posizione del decubito laterale.

Segnare il limite interno del lembo dalla spina iliaca superiore anteriore, o ASIS, verso la rotula laterale e un confine posteriore di circa 8-10 centimetri caudalmente. Usa un bisturi per fare un'incisione acuta sul margine distale della rotula. Approfondire l'incisione attraverso i tessuti sottocutanei per raggiungere la fascia sovrastante il retto femorale e continuare le incisioni verso l'ASIS lungo i confini marcati.

Per isolare il lembo fasciale da solo, rimuovere la componente cutanea sovrastante dallo strato di fascia sottostante. Quindi legare o cauterizzare piccoli vasi perforatori sulla pelle. Tornare al bordo distale del lembo e incidere la fascia profonda.

Mobilitare la fascia dal muscolo vasto laterale sottostante verso l'ASIS. Dopo aver tracciato il peduncolo verso i vasi femorali profondi, scheletrizzare l'arteria femorale circonflessa laterale e la vena che fornisce il lembo fasciale. Quindi legare e dividere i vasi dei lembi in modo prossimale, dove si uniscono ai vasi femorali profondi e consentono un successivo incannulamento.

Per l'approvvigionamento del lembo dell'avambraccio radiale, segnare un quadrato di 3 per 3 centimetri sull'aspetto radiale di un avambraccio di maiale esteso. Tracciare una linea tra il punto medio del margine del lembo prossimale e la fossa antecubitale per indicare il decorso approssimativo del peduncolo dell'arteria radiale. Confermare il decorso arterioso con la palpazione.

Quindi, incidere la pelle usando un bisturi all'aspetto distale con una profondità fino alla fascia antebrachiale. Sezionare smussata con forbici per tenotomia fino a quando non si incontrano l'arteria radiale distale e la sua vena comitantes. Quindi legare e dividere l'arteria e le vene con fascette chirurgiche o clip.

Continuare le incisioni cutanee sui margini radiale e ulnare del quadrato cutaneo marcato. Quindi mobilitare il lembo dall'osso radiale sottostante con una lama chirurgica o un cauterizzazione, procedendo da una direzione ulnare a radiale mentre si solleva il lembo cutaneo prossimalmente verso la fossa antecubitale. Usando le forbici per tenotomia, scheletrizzano l'arteria radiale e la vena comitante prossimalmente alla fossa antecubitale, dove si uniscono rispettivamente all'arteria brachiale e alle vene.

Sezionare i vasi dai tessuti fibro-grassi circostanti per isolare il peduncolo vascolare. Quindi legare e dividere l'arteria e la vena separatamente per liberare il lembo dell'avambraccio radiale. Quindi, cannulare i vasi peduncolari con angiocatetere da 20 a 24 calibro fissato con cravatte di seta 3-0.

Lavare la soluzione salina eparinizzata nella cannula arteriosa del lembo fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso. Mentre si lavora in un armadio di biosicurezza a flusso laminare, posizionare i lembi nella camera di tessuto del bioreattore. Tubo di afflusso primario con soluzione salina eparinizzata sterile per rimuovere l'aria residua e disporre i lembi per consentire il collegamento tra la cannula arteriosa del lembo e il connettore luer maschio.

Quindi utilizzare emostati sterili per avvitare la cannula arteriosa sul connettore. Quindi lavare la soluzione salina eparinizzata attraverso il rubinetto di arresto per verificare che la connessione luer sia priva di perdite e che i flop possano essere perfusi con evidenza di deflusso venoso. Dopo aver chiuso il coperchio della camera del tessuto, collegare il tubo di afflusso con un tubo giallo della pompa a 3 stop al rubinetto di arresto dell'afflusso della camera del tessuto.

Inoltre, collegare un trasduttore del sensore di pressione in linea al rubinetto di arresto a 3 vie di afflusso per il monitoraggio della pressione di perfusione. Quindi, accendere la pompa peristaltica di afflusso e nella schermata iniziale, passare alla terza scheda utilizzando la freccia per impostare l'ID del tubo su 1,85 millimetri. Quindi impostare la velocità di perfusione dalla seconda scheda.

La velocità di ingresso come modalità di consegna è impostata su 2 millilitri al minuto. Assicurarsi che la direzione del flusso sia corretta come visualizzata sullo schermo. Caricare il tubo della pompa a 3 stop sulla pompa peristaltica con una cassetta compatibile.

Impostare l'impostazione della pompa di deflusso su una velocità di 4 millilitri al minuto. Collegare il tubo di deflusso con un tubo giallo della pompa a 3 arresti al rubinetto di arresto del deflusso della camera tissutale. Quindi caricare il tubo della pompa a 3 arresti sulla pompa peristaltica e avviare il flusso per entrambe le pompe premendo il pulsante di accensione su ciascuna pompa.

Iniziare la decellularizzazione perfusionale dei lembi con soluzione salina eparinizzata nella camera tissutale per 15 minuti per rimuovere eventuali coaguli di sangue trattenuti. Al termine, sostituire la soluzione salina residua con 500 millilitri di sodio dodecilsolfato, o SDS, soluzione di decellularizzazione per immergere il lembo. Quindi, trasferire il tubo di afflusso alla soluzione SDS e abbondante il tessuto.

Dopo la decellularizzazione della SDS, aspirare la SDS rimanente prima di perfondere il lembo con PBS per un giorno. Dopo la decellularizzazione della perfusione SDS, perfondere sequenzialmente i lembi nella soluzione di DNA per due ore, e poi in PBS per un giorno, seguito dal trasferimento del tubo di afflusso in acido peracetico ed etanolo in acqua distillata per sterilizzare i lembi perfondendo per tre ore. Una volta fatto, rimuovere i lembi in modo asettico e immergerli in due lavaggi di PBS contenenti antimicotici antibiotici all'1% per 15 minuti ciascuno.

Conservare i lembi a 4 gradi Celsius fino al momento della ricellularizzazione. Utilizzare uno strumento di biopsia da 3 a 10 millimetri per ottenere campioni di tessuto per la valutazione dei lembi decellularizzati. I lembi decellularizzati isolati lavati sotto controllo manuale hanno dimostrato evidenza di deflusso dalla cannula venosa liberamente drenante dell'omento, della fascia tensoriale lata e del lembo radiale dell'avambraccio.

La morfologia grossolana dell'omento nativo, della fascia tensoriale lata e dei lembi radiali dell'avambraccio appariva di colore rosa subito dopo l'approvvigionamento. In confronto, i tessuti decellularizzati erano tipicamente bianchi o opachi nell'aspetto. L'esame istologico dei tessuti nativi con ematossilina ed eosina ha mostrato la presenza di nuclei blu.

Nei lembi decellularizzati, la colorazione istologica ha rivelato la perdita di materiale cellulare senza colorazione nucleare blu, indicando un'impalcatura del tessuto acellulare. Un'ulteriore quantificazione del contenuto di DNA ha mostrato una significativa diminuzione del DNA negli scaffold acellulari rispetto ai tessuti nativi. La considerazione più importante è una tecnica chirurgica utilizzata durante l'approvvigionamento, avendo cura di evitare danni al peduncolo del lembo al fine di consentire la successiva decellularizzazione della perfusione.

Dopo la decellularizzazione per perfusione, i lembi risultanti possono essere ricellularizzati con popolazioni cellulari tessuto-specifiche al fine di rigenerare i compartimenti tissutali nativi.