Immunofluorescenza multipla combinata con analisi di immagini spaziali per la valutazione clinica e biologica del microambiente tumorale
2 giugno 2023
In questo articolo viene descritto un protocollo per l'immunofluorescenza multipla (mIF) manuale di amplificazione del segnale di tiramido (TSA) combinato con l'analisi delle immagini e l'analisi spaziale. Questo protocollo può essere utilizzato con sezioni FFPE (paraffina-embedded fissate in formalina) per la colorazione di due o sei antigeni per vetrino a seconda dello scanner di vetrini disponibile in laboratorio.
Nel nostro laboratorio, stiamo studiando il cancro del colon-retto umano. La sua progressione verso la malattia metastatica e la sua risposta al trattamento, compresa l'immunoterapia. Stiamo cercando di trovare nuovi biomarcatori predittivi e prognostici studiando il microambiente immunitario tumorale e il microbioma intratumorale nella malattia primaria e metastatica.
Nel nostro progetto stiamo attualmente implementando diverse tecnologie come il sequenziamento dell'RNA, il sequenziamento dell'intero esoma, il sequenziamento TCR dell'analisi del DNA libero da cellule circolanti, l'immunofluorescenza e l'ibridazione dell'istituto di fluorescenza. In questo momento, la nostra sfida principale è quella di combinare la colorazione di ibridazione dell'istituto di fluorescenza con l'immunofluorescenza multiplex di amplificazione del segnale del timide per studiare l'interazione tra il microbioma e le cellule immunitarie. Il nostro metodo è robusto, riproducibile, facile da usare ed economico.
Può essere installato in qualsiasi laboratorio che possieda uno scanner a luce fluorescente e il metodo può essere utilizzato con qualsiasi anticorpo IHC disponibile in commercio in opposizione ai kit disponibili in commercio che di solito sono ottimizzati per pannelli ristretti di antigeni.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo per l'amplificazione manuale del segnale mediante tiaramide (TSA) con immunofluorescenza multicanale (mIF) abbinata ad analisi dell'immagine e analisi spaziale. Il metodo è applicabile a sezioni in paraffina con fissazione a formalina (FFPE) per la colorazione di multipli antigeni per ogni vetrino.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Patologia
Sfondo
- Studio del cancro del colon-retto umano e della sua progressione.
- Concentrazione sull'ambiente immunitario tumorale e sul microbioma intratumorale.
- Utilizzo di diverse tecnologie, tra cui il sequenziamento dell'RNA e l'immunofluorescenza.
- Sfide nell'unire diversi metodi di colorazione per un'analisi completa.
Scopo dello studio
- Trovare nuovi biomarcatori predittivi e prognostici.
- Studiare l'interazione tra il microbioma e le cellule immunitarie.
- Sviluppare un metodo di colorazione robusto e riproducibile.
Metodi Utilizzati
- Amplificazione del segnale con tiaramide manuale mediante immunofluorescenza multicanale.
- Analisi delle immagini mediante algoritmi di fluorescenza ad alto multiplex.
- Ibridazione fluorescente in situ abbinata a immunofluorescenza.
- Protocollo dettagliato di colorazione per sezioni di tessuto FFPE.
Risultati principali
- Colorazione riuscita di multipli antigeni su un singolo vetrino.
- Ottimizzazione della specificità degli anticorpi e del rapporto segnale-rumore.
- Analisi dell'immagine efficace che produce dati quantificabili.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo in diversi laboratori.
Conclusioni
- Il metodo TSA mIF è versatile ed economico.
- Può essere adattato per diversi anticorpi e antigeni.
- Questo approccio migliora la comprensione della biologia tumorale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immunofluorescenza multiplex (mIF) con analisi spaziale delle immagini consente una mappatura quantitativa ad alto contenuto del microambiente tumorale (TME), supportando la scoperta di biomarcatori e la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi oncologici. Questo flusso di lavoro fornisce informazioni utili sulle interazioni tra cellule immunitarie e stromali, orientando le strategie predittive di biomarcatori e la ricerca traslazionale. La sua riproducibilità e compatibilità con diversi anticorpi lo posizionano come capacità scalabile per la ricerca e sviluppo oncologica su scala aziendale.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biofarmaceutici
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi spazialmente risolta delle interazioni tra cellule immunitarie e tumorali per la validazione di bersagli.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica quantificando le densità e le prossimità dei diversi tipi cellulari all'interno dei compartimenti tumorali.
- Facilita l'identificazione di nuovi biomarcatori predittivi e prognostici per la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi tissutali validati per lo screening multiplex di biomarcatori successivi.
- Fornisce dati spaziali standardizzati, riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi.
- Consente una valutazione robusta della specificità degli anticorpi e dell'ottimizzazione del rapporto segnale-rumore per la preparazione allo screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea l'analisi spaziale dei biomarcatori a modelli rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando le caratteristiche del microambiente tumorale (TME) a ipotesi di risposta terapeutica.
- Fornisce output quantitativi per confronti trasversali tra studi e coorti nella ricerca preclinica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro di analisi mIF e spaziale collega la fase iniziale di scoperta, la validazione dei biomarcatori e la ricerca traslazionale nei portafogli di oncologia.
- Biologia della scoperta: Quantifica le distribuzioni delle cellule immunitarie e stromali per chiarire i meccanismi guidati dal microambiente tumorale (TME).
- Screening: Standardizza saggi su tessuti multiplex per ottenere letture quantitative e riproducibili.
- Analisi: Esporta dati spaziali e di densità per il confronto statistico tra compartimenti tumorali e interazioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: Collega i modelli spaziali dei biomarcatori alla risposta terapeutica, sostenendo la continuità tra fase preclinica e clinica.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a qualsiasi pannello di anticorpi e tipo di tumore, consentendo un'ampia applicazione a livello di portafoglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione di biomarcatori e target risolvendo le interazioni cellulari spaziali.
- Valore operativo: Fornisce analisi multiplex di tessuti riproducibili, scalabili ed economicamente efficienti.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto e riduce il rischio biologico in fasi avanzate attraverso una caratterizzazione robusta del microambiente tumorale (TME).
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione di asset oncologici aggiustata per il rischio, basata su evidenze spaziali dei biomarcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immunofluorescenza, nell'analisi delle immagini e nell'elaborazione statistica dei dati.
- Necessita dell'accesso a uno scanner di lastre fluorescenti e a un software compatibile per l'analisi delle immagini.
- Richiede una standardizzazione intersquadre della validazione degli anticorpi e dei protocolli di colorazione.
- Adattabile a diversi tipi di tumore e panel di anticorpi con un'opportuna ottimizzazione.
- Dipende da una rigorosa specificità degli anticorpi e da un'ottimizzazione del rapporto segnale-rumore per ottenere risultati affidabili.
