Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA
4 agosto 2023
Questo protocollo descrive la procedura per l'editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.
Il nostro laboratorio studia l'interazione tra micobatterio, tubercolosi e sistema immunitario dell'ospite, con particolare attenzione all'interazione iniziale tra il batterio e il macrofago. C'è una varietà di tecniche di distruzione genica utilizzate nei macrofagi, comprese le tecnologie RNAi e le tecnologie CRISPR. Una delle principali sfide è la bassa efficienza della distruzione genica nei macrofagi.
Questo protocollo consente la manipolazione genetica rapida e ad alta efficienza dei macrofagi primari senza la necessità di clonazione e costruzione plasmidici. Questi metodi dovrebbero essere ampiamente applicabili in immunologia, consentendo ai ricercatori di interrompere i geni nei macrofagi primari per un'ampia gamma di studi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la modifica del genoma in macrofagi derivati dal midollo osseo murino mediante complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA. L'approccio migliora l'efficienza della manipolazione genetica nei macrofagi primari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Ingegneria genetica
- Biologia dei macrofagi
Sfondo
- I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria.
- Le tecniche di interruzione genica sono essenziali per lo studio delle funzioni dei macrofagi.
- I metodi tradizionali sono spesso afflitti da bassa efficienza.
- Questo protocollo affronta queste sfide consentendo una manipolazione genetica ad alta efficienza.
Scopo dello studio
- Migliorare l'efficienza di interruzione genica nei macrofagi primari.
- Facilitare la manipolazione genetica rapida senza clonaggio.
- Fornire un metodo applicabile a diversi studi immunologici.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio in vitro di complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA.
- Consegna di questi complessi mediante elettroporazione.
- Impostazione di parametri specifici per l'elettroporazione (ad esempio, 1.900 volt, 20 millisecondi).
- Applicazione in macrofagi derivati da midollo osseo di topo primario.
Risultati principali
- Dimostrata elevata efficienza di interruzione genica nei macrofagi.
- Consentita una manipolazione genetica rapida senza la necessità di plasmidi.
- Mostrata un'ampia applicabilità per varie ricerche immunologiche.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per la manipolazione genetica nei macrofagi.
- Permette di superare le precedenti difficoltà relative all'efficienza di interruzione genica.
- I ricercatori possono utilizzare questo metodo per svariati studi nel campo dell'immunologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La perturbazione genica efficiente nei macrofagi derivati dal midollo osseo primario (BMDMs) affronta un collo di bottiglia fondamentale nella scoperta di farmaci incentrata sull'immunologia, consentendo una genomica funzionale rapida e ad alta affidabilità in cellule primarie rilevanti per la malattia. L'elevata efficienza di editing e il flusso di lavoro semplificato di questo protocollo supportano una valida conferma dell'obiettivo e una riduzione del rischio meccanicistica nei punti critici iniziali della scoperta. L'approccio migliora l'affidabilità predittiva per la selezione del portafoglio e accelera la traduzione degli approfondimenti genetici in ipotesi terapeutiche attuabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi diretta della funzione genica nei macrofagi primari, supportando la riduzione del rischio meccanicistica.
- Facilita la rapida validazione di bersagli terapeutici in un sistema fisiologicamente rilevante.
- Consente studi ad alta affidabilità di perdita di funzione per la chiarificazione delle vie metaboliche.
- Migliora il valore predittivo per le decisioni strategiche successive nel portafoglio di sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi di cellule primarie validati per schermature fenotipiche a valle.
- Fornisce risultati quantitativi riproducibili di interruzione genica per la standardizzazione dei saggi.
- Permette flussi di lavoro scalabili e privi di plasmidi, adatti a campagne di screening iterative.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti nei macrofagi modificati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la manipolazione genetica alla biologia dei macrofagi rilevante per le malattie, garantendo continuità traslazionale.
- Facilita lo sviluppo di modelli preclinici mediante l'uso di cellule primarie con modifiche genetiche definite.
- Riduce il rischio biologico collegando la scoperta alla validazione preclinica in sistemi primari.
- Supporta la scoperta di biomarcatori e studi meccanicistici nei percorsi di immunologia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro CRISPR basato sull'elettroporazione si integra nelle fasi iniziali di scoperta e di validazione del bersaglio, consentendo un passaggio senza interruzioni all'identificazione del capostazione e alla ricerca preclinica in percorsi mirati all'immunologia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e l'analisi dei percorsi biologici nei macrofagi primari.
- Screening: Fornisce un'interruzione genica riproducibile e quantitativa per la preparazione dei saggi.
- Analisi: Permette la valutazione dell'efficienza di editing basata sul sequenziamento Sanger per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la rilevanza per le malattie utilizzando cellule primarie per studi genetici.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e ampiamente applicabile per la manipolazione genetica in progetti di immunologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dell'obiettivo.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro con elevata efficienza, riproducibilità e senza costruzione di plasmidi.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go e un'allocazione delle risorse efficiente in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di asset in immunologia con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di cellule primarie e nell'assemblaggio di complessi CRISPR RNP.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per elettroporazione e infrastruttura per sequenziamento Sanger.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità negli studi multicentrici.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per altri tipi cellulari primari o specie.
- L'efficienza di editing e la vitalità cellulare devono essere validate empiricamente per ogni bersaglio genico.
